固相萃取/高效液相色譜-串聯質譜法同時檢測環境水樣中24種農藥殘留

何 欣，馬洋帆，趙紅霞，聶曉靜

(大連理工大學 環境學院，工業生態與環境工程教育部重點實驗室，遼寧 大連 116024)

固相萃取/高效液相色譜-串聯質譜法同時檢測環境水樣中24種農藥殘留

何 欣*，馬洋帆，趙紅霞，聶曉靜

(大連理工大學 環境學院，工業生態與環境工程教育部重點實驗室，遼寧 大連 116024)

建立了一種固相萃取/高效液相色譜-串聯質譜(SPE/HPLC-MS/MS)同時檢測水體中24種農藥的分析方法。樣品用乙腈提取后，經固相萃取小柱富集凈化。以乙腈-0.1%(體積分數)甲酸水溶液為流動相梯度洗脫，在電噴霧離子源正離子模式下(ESI+)采用多反應監測(MRM)模式檢測。結果顯示，24種農藥在1～200 μg/L范圍內具有良好的線性關系，相關系數(r2)均不小于0.998，水樣中3個添加水平(5、20、100 μg/L)下的回收率為65.9%～127.8%，相對標準偏差(RSD)為0.7%～14.2%；方法檢出限為0.05～0.71 ng/L。采用該方法對大連地區10個河流入海口及2個水庫的水樣進行了檢測，12個站位的樣品中共檢出10種農藥，質量濃度為0.2～558.3 ng/L。結果表明，所建立的SPE/HPLC-MS/MS方法高效、靈敏、可靠，可用于實際水體中多種農藥的同時檢測。

固相萃取；高效液相色譜-串聯質譜；農藥；水樣檢測

農藥因可以滅殺昆蟲、真菌和其他危害農作物生長的生物而廣泛用于世界各國[1]。現代農業科學的不斷發展，使得越來越多種類的農藥應用于農作物中，在提高農作物產量的同時，也對環境產生了巨大的危害，其所產生的污染成為我國影響范圍最大的一種有機污染[2]。我國的農藥利用率低，大部分農藥會殘留在環境中，通過降水、地表徑流、土壤淋溶等途徑進入水體，從而破壞水生生態系統的平衡，特別是農田附近的河流和湖泊污染嚴重，魚類死亡率高，甚至引起人類的健康問題。

由于環境基質復雜多變，故對建立同時檢測環境中多種農藥殘留的方法要求較高。目前，農藥的檢測方法主要是液液萃取、固相萃取和固相微萃取等前處理方法結合色譜分析技術，如氣相色譜-質譜(GC-MS)[3-4]、氣相色譜-串聯質譜(GC-MS/MS)[5]、高效液相色譜(HPLC)[6-7]、高效液相色譜-質譜(HPLC-MS)[8-9]、高效液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS)[10-11]、超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)[12-13]等。多反應監測模式的HPLC-MS/MS因具有特異性強、靈敏度高、線性動態范圍寬等特點，而被廣泛用于農藥的檢測[14-17]。

國內對農藥殘留的分析局限于農作物和土壤，目前已報道的水體中快速、高效的農藥檢測方法有限，且所檢測農藥的種類較少。江陽等[18]分析了飲用水中13種農藥的殘留情況，簡化了樣品前處理的過程，但雜質干擾較大，檢出限較高，不能滿足更低殘留量的檢出要求。閆鳳麗等[19]檢測了環境水體中6種磺酰脲類除草劑殘留，前處理采用固相膜萃取，易于堵塞，傳質阻力較大，檢出限較高，并且單一的液相色譜分析技術靈敏度較低，選擇性較差，不能滿足復雜水體中多種類農藥的同時檢測需求，因此對水體中多種類農藥高效準確分析方法的開發尤為重要。

本研究采用SPE/HPLC-MS/MS技術，建立了水體中13種磺酰脲類除草劑、3種酰胺類除草劑、3種新煙堿類殺蟲劑和其他5種農藥同時測定的分析方法。經過SPE前處理技術，水樣富集倍數高，可用于實際水樣中微量農藥的殘留分析，并且對固相萃取小柱、洗脫溶劑、上樣pH值等前處理的實驗條件進行了優化。該方法成功應用于實際10個河流入海口及2個水庫水樣中目標農藥殘留的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

液相色譜：Agilent 2100 SL，安捷倫科技有限公司；質譜：Agilent 6410B 三重四極桿串聯質譜儀，安捷倫科技有限公司；色譜柱：Xterra?MS C18(3.5 μm,2.1 mm×100 mm)，沃特世科技(上海)有限公司；真空固相萃取裝置：12管防交叉污染型，Supelco公司。乙腈(色譜純，Sigma-Aldrich公司)；甲醇(色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司)；甲酸(分析純，天津天河化學試劑廠)；超純水(18.2 MΩ·cm,Milli-Q Water公司)。

標準品：噻吩磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆、醚苯磺隆、氯磺隆、酰嘧磺隆、三氟啶磺隆鈉鹽、甲磺胺磺隆、煙嘧磺隆、芐嘧磺隆、吡嘧磺隆、氯吡嘧磺隆、氟胺磺隆、撲草凈、嗪草酮、噻蟲啉、氯噻啉、氟蟲腈、除草定、噻蟲嗪、異丙甲草胺、乙草胺、丁草胺、丙環唑，均購自北京百靈威科技有限公司，純度均高于98%。

1.2 液相色譜-質譜/質譜分析條件

液相色譜條件：Waters Xterra MS C18(3.5 μm,2.1 mm×100 mm)色譜柱，流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈，流速0.25 mL/min，洗脫梯度程序：0～10 min，25%B；10～15 min，25%～50%B；15～20 min，50%～60%B；20 min后，100%B。

質譜條件：電噴霧離子源，正離子掃描模式，干燥氣溫度為350 ℃，干燥氣流速為8 L/min，毛細管電壓為4 000 V，電噴霧壓力為25 psi。

1.3 樣品前處理

水樣經0.45 μm玻璃纖維濾膜過濾，用量筒準確量取500 mL于棕色玻璃瓶中，用鹽酸調至pH 3.5，隨后進行固相萃取。首先分別用10 mL乙腈、超純水和pH 3.5的超純水活化小柱，然后導入水樣，控制流速為5 mL/min。用pH 3.5的超純水沖洗瓶子和柱子，并在真空條件下抽干。用10 mL乙腈對固相萃取柱進行洗脫，使其在重力作用下，自由滴落，在水浴氮吹儀上氮吹至近干，然后用0.1%甲酸水-乙腈溶液(8∶2)定容至500 μL于液相小瓶中，渦旋待測。

2 結果與討論

2.1 儀器條件優化

2.1.1質譜條件優化將儲備液稀釋至20 μg/L后，對其質譜條件進行優化。采用全掃描模式(Scan)確定目標物的母離子；采用選擇離子掃描模式(SIM)，優化碎裂電壓(Fragmentor)；在子離子掃描模式(Product ion)下，確定碎片離子；在多重反應監測模式(MRM)下，優化碰撞能量(CE)。通過優化得到的母離子、子離子、去簇電壓和碰撞能量如表1所示。

表1 24種農藥的質譜檢測參數Table 1 MS detection parameters of the 24 pesticides

*quantitative ion;CE:collision energy

圖1 24種農藥標準樣品的色譜圖Fig.1 HPLC-MS/MS chromatogram of the 24 pesticides standards1.thiamethoxam;2.imidaclothiz;3.thiacloprid;4.bromacil;5.nicosulfuron;6.metribuzin;7.thifensulfuron-methyl;8.prometryn;9.metsulfuron-methyl;10.sulfometuron-methyl;11.triasulfuron;12.chlorsulfuron;13.amidosulfuron;14.trifloxysulfuron-sodium;15.mesosulfuron-methyl;16.bensulfuron-methyl;17.pyrazosulfuron-ethyl;18.halosulfuron-methyl;19.triflulsulfuron-methyl;20.metolachlor;21.acetochlor;22.propiconazole;23.fipronil;24.butachlor

2.1.2流動相優化由于實驗采用ESI+模式，而酸性條件一般可提高[M+H]+化合物的正離子響應，因此選用酸性流動相，可以加強離子化效率，從而提高檢測靈敏度[20]，所以在水相中添加甲酸來增強農藥的分離度。實驗考察了0.1%甲酸水溶液、0.2%甲酸水溶液、0.3%甲酸水溶液分別與甲醇、乙腈為流動相時對分離效果和質譜響應的影響。結果表明，當有機相為乙腈，水相為0.1%的甲酸水溶液時，24種農藥在出峰位置和峰形一致的情況下具有更大的峰面積，因此采用乙腈為有機相，0.1%的甲酸水溶液作為水相。

由于所分析的目標物種類較多，為縮短儀器的分析周期，提高儀器的分析能力，選擇合適的洗脫梯度至關重要。實驗中不斷優化有機相與水相的配比，最終得到24種農藥標準樣品在100 μg/L質量濃度下的總離子流圖如圖1所示。

2.2 前處理方法優化

環境水體的基底復雜，且農藥殘留濃度一般較低，為去除基底干擾以及提高農藥檢測的靈敏度，需對樣品進行前處理。由于固相萃取(SPE)具有回收率高、富集倍數高、萃取時間短以及有機溶劑用量少等優點，被廣泛應用于樣品預處理[21-23]。

2.2.1固相萃取柱的優化考察了Sep-Pak C18和Oasis HLB兩種固相萃取小柱在100 μg/L加標水平下對24種農藥的富集和回收效果，3組平行實驗的結果如圖2所示。對于大部分農藥來說，兩種SPE柱差別較小，但噻蟲嗪、甲磺隆、氯磺隆、氟胺磺隆、丁草胺在C18柱的回收率較低，分別為19.02%、52.67%、55.75%、60.71%、44.82%；在HLB柱的回收率為82.3%～108.1%，且重現性較好。因此，本方法采用Oasis HLB作為SPE小柱。

圖2 不同固相萃取柱對24種農藥凈化效果的比較Fig.2 Comparison of the clean-up effects of different SPE cartridges for 24 target pesticides

2.2.2洗脫溶劑的優化洗脫劑的組成在SPE萃取過程中決定著分析物是否被完全洗脫，從而影響分析物的回收率[24]。實驗比較了洗脫溶劑體積(6、8、10、12 mL)對回收率的影響，結果發現洗脫溶劑的體積為10 mL時，目標物的回收率最優。其次，考察了乙腈和甲醇兩種洗脫溶劑在100 μg/L加標水平下對24種農藥回收率的影響，進行3組平行實驗。當用乙腈作為洗脫溶劑時，得到22種農藥的回收率為82.3%～108.1%，甲嘧磺隆的回收率為127.8%，丁草胺的回收率為68.8%；而用甲醇作為洗脫溶劑時，異丙甲草胺、乙草胺、丁草胺和噻吩磺隆的回收率較低，分別為54.07%、47.55%、37.95%、62.75%。相對于甲醇來說，乙腈作為洗脫溶劑時3個平行實驗的相對標準偏差(RSD)為0.7%～11.7%，比較穩定。因此，本方法采用乙腈作為固相萃取的洗脫溶劑。

2.2.3洗脫溶劑的優化水樣的酸堿性可影響農藥在水中存在的狀態(離子態、分子態)、穩定性以及與固相萃取小柱填料的相互作用[25]，從而影響目標物的回收率。由于本方法所選的農藥大部分為弱酸性，因此選用酸性的水樣環境更利于農藥的富集。實驗中采用鹽酸將水樣的pH值分別調至2.5、3.5、4.5，每組平行3次。結果發現，當上樣的pH值為3.5時，24種農藥的回收率普遍較優，并且3次平行實驗的RSD相對穩定。因此，本方法選擇將水樣調至pH 3.5后上樣。

2.3 標準曲線、檢出限

實驗中配制2、5、10、20、50、100 μg/L質量濃度的標準工作溶液，繪制標準曲線。由于撲草凈和異丙甲草胺的檢出限較高，氟蟲腈的檢出限較低，因此繪制撲草凈和異丙甲草胺的標準曲線時，其濃度梯度為其他21種農藥的1/2；氟蟲腈為其他21種農藥濃度的2倍。以各目標物色譜峰的信噪比(S/N)等于3來確定儀器的檢出限(IDL)，方法的檢出限(MDL)換算為濃縮1 000 倍前水樣中可檢出的目標物質量濃度(ng/L)。24種農藥的線性關系、IDL和MDL見表2。結果表明，24種農藥的線性相關系數(r2)均不小于0.998，方法檢出限為0.05～0.71 ng/L，該方法的線性范圍好，檢出限低，靈敏度高。

表2 24種農藥的線性關系、儀器檢出限和方法檢出限Table 2 Linear relationship,IDLs and MDLs of the 24 pesticides

2.4 回收率與精密度

選取不含目標分析物的地表水樣品進行精密度和加標回收率的試驗。24種標準品的加標水平為5、20、100 μg/L，每組平行實驗3次(n=3)，計算加標回收率，結果如表3所示。24種農藥的加標回收率為65.9%～127.8%，RSD為0.7%～14.2%，表明該方法的精密度和回收率符合殘留分析要求。

表3 水樣中24種農藥的加標回收率和相對標準偏差(n=3)Table 3 Spiking recoveries and relative standard deviations of the 24 pesticides in water samples(n=3)

2.5 實際樣品的分析

采用所建立的方法對大連地區10個河流入海口及2個水庫水樣中的農藥進行了分析，共檢出10種農藥，農藥殘留情況如表4所示。由表可知，水體中檢出的10種農藥的殘留量為0.2～558.3 ng/L，氯磺隆、除草定、乙草胺的檢出率低，檢出濃度相對較低；氯噻啉、撲草凈、異丙甲草胺的檢出率高，并且檢出濃度也較高。其中，S4(黃石礁)水樣中撲草凈的濃度最大，為558.3 ng/L。

表4 12個地點水樣中農藥的分析結果Table 4 Analytical results of pesticides in water samples of 12 sites

-:not detected

3 結 論

本研究建立了固相萃取/高效液相色譜-串聯質譜(SPE/HPLC-MS/MS)同時檢測水體中常見24種農藥的檢測方法，該方法高效快速、準確可靠，檢出限低，可滿足多種農藥殘留的分析要求，具有很大的應用前景。

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Simultaneous Determination of 24 Pesticide Residues in Environmental Water Using Solid-phase Extraction and High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

HE Xin*,MA Yang-fan,ZHAO Hong-xia,NIE Xiao-jing

(Key Laboratory of Industrial Ecology and Environmental Engineering of Ministry of Education,College of Environment,Dalian University of Technology,Dalian 116024,China)

A method of solid-phase extraction(SPE) and high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(SPE/HPLC-MS/MS) was developed for the simultaneous determination of 24 pesticides in water.The samples were extracted with acetonitrile,then enriched and purified with solid-phase extraction cartridges.Acetonitrile and 0.1%(by volume) formic acid aqueous solution were used as mobile phases.Target pesticides were analyzed by HPLC-MS/MS in positive electrospray ionization(ESI+) under multiple reaction monitoring(MRM) mode.Results showed that 24 pesticides were separated in 25 min with excellent linear relationships(r2≥0.998).The recoveries at spiked levels of 5,20,100 μg/L in water samples ranged from 65.9%-127.8% with relative standard deviations(RSDs) of 0.7%-14.2%.The limits of detection were in the range of 0.05-0.71 ng/L.This method was applied in the detection of the water samples from 10 estuaries and 2 reservoirs in Dalian，and 10 pesticides were detected in the concentration range of 0.2-558.3 ng/L.The proposed SPE/HPLC-MS/MS method is efficient and sensitive,and is suitable for the determination of various pesticides in actual water samples.

solid-phase extraction(SPE);high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS);pesticides;water detection

2017-07-19；

2017-08-30

中央高校基本科研業務費(DUT15LAB04)

*

何 欣，博士，工程師，研究方向：環境分析化學，E-mail:hexin@dlut.edu.cn

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.12.012

O657.63；O657.7

A

1004-4957(2017)12-1487-07