武夷茶中苯醚甲環唑的殘留檢測

李凌

福建林業職業技術學院,福建 南平 353000

中國是最早種植茶葉的國家[1]，茶葉不僅富含礦物質元素和蛋白質，而且還含有茶多糖以及茶多酚等功能性成分[2]。茶葉在生長過程中極易發生不同種類的病蟲害，由這些病蟲害引起的一系列問題會使得茶葉的品質下降，最終造成茶種植業嚴重虧損[3]。化學方法是目前我國對茶葉病蟲害治理的主要手段，不僅對茶葉的品質造成了影響，還會對生態環境造成不可修復的損傷[4]。

我國檢測茶葉農藥殘留的方法主要有氣相色譜法（GC）、氣象色譜質譜聯用法（GC-MS）以及液相色譜質譜聯用法（LC-MS）等[5]，這些化學分析方法在重復性以及靈敏度方面具有較大的優勢，但設備造價昂貴，樣品前處理要求較高等都是不可忽視的問題，這些缺點使得茶葉大規模檢測變得較為困難。研究設計一種精密度好、準確度高的檢測方法，對于茶葉的大規模檢測有著深遠的意義[6]。本文采用SERS技術快速分析茶葉中苯醚甲環唑農藥殘留并結合快速溶劑前處理的方法[7]。通過乙腈提取茶葉，利用變壓吸附（PSA）和納米竹炭（NBC）去除茶葉中的有機酸和生物堿等熒光物質。樣本的基底采用OTR202金納米顆粒作為增強物質，采集苯醚甲環唑以及乙腈溶液的表面增強拉曼光譜，并用SERS檢測含苯醚甲環唑標準溶液的茶葉樣本，檢出農藥殘留樣本的最低濃度，建立農藥殘留的預測模型并用偏最小二乘法進行數值計算，對測得的原始光譜進行預處理，并對理論值進行分析比對，最終得到了適合茶葉大規模檢測的方法。

1 預測模型的建立

1.1 偏最小二乘法的數學模型

偏最小二乘法即PLS，是一種常用的多因子分析方法[8]。在利用偏最小二乘法進行數值計算時，通過交換因變量Y與自變量X的得分，使得被分析成分含量與主成分直接發生關聯。

交互驗證均方根誤差即RMSECV，作為偏最小二乘法的評價指標，常被用來衡量方法的準確性。

RMSECV的計算公式如上所示，其中，n為樣本總數，yi為第i個樣本的實測值，為第i個樣本的預測值。由公式可知，實測值與預測值的差值越小即得到的RMSECV計算值越小，最后的效果越好。

預測均方根誤差即RMSEP，作為樣本預測能力的評價標準，其數值大小與預測能力緊密相關，數值越大，預測能力越低。

上式為預測均方根誤差的計算公式，其中，yi和^分別為集合中第i個樣本的實測值與預測值。

相關系數r用于考察樣本實測值與預測值之間的相關性，當預測值與實測值之間的相關性越好時，r值越接近1。

2 試驗方法

2.1 實驗材料與儀器

苯醚甲環唑標準品（99%，Stanford Chemical），乙酸乙酯（色譜純，天津福晨化工公司），乙腈（色譜純，百靈威科技有限公司），PSA（北京迪馬科技有有限公司），納米竹炭（100 nm，安吉滄海精細化工有限公司），OTR202和OTR103（Opto Trace Technologies），鮮茶葉和干茶葉均取自福建省武夷山市的武夷茶。

K-Sens-532高靈敏度激光拉曼光譜儀（上海復享光學有限公司），Agilent 7890A氣相色譜質譜聯用儀（美國安捷倫科技有限公司），JOYN-DCY-24S型水浴吹氮儀（上海喬躍電子有限公司），STLH-32低速離心機（天津美特斯試驗機廠）。

2.2 干茶葉樣本制備

（1）將沒有農藥殘留（陰性）的武夷茶干茶葉平均分成20份，每份重量保持在15 g左右。

（2）用色譜純的乙腈將苯醚甲環唑的標準溶液稀釋成20份不同濃度的溶液，每份溶液的體積為50 mL。濃度為0 mg/mL，編號為1；濃度為5 mg/mL，編號為2；濃度為10 mg/mL，編號為3；濃度范圍15～27 mg/mL內間隔為3 mg/mL，編號為4～8；濃度范圍28～31 mg/mL內間隔為1 mg/mL，編號為9～12；濃度范圍32～42 mg/mL內間隔為2 mg/mL，編號為13～18；濃度45 mg/mL，編號為19，濃度55 mg/mL，編號為20。

（3）將配置好的溶液均勻噴灑到干茶葉上，得到20個樣本，干燥后粉碎備用。

2.3 干茶葉樣品前處理的優化

PSA用量優化：將含有苯醚甲環唑農殘的茶葉提取液均分為3份，分別裝到25 mg、50 mg、75 mg PSA的離心管中，劇烈振蕩5 min后，以4500 r/min的轉速離心20 min，將上清液過濾備用。

NBC用量優化：經苯醚甲環唑浸泡過的茶葉粉碎后取上層液，分別裝到25 mg、30 mg、35 mg的離心管中，劇烈振蕩5 min，以4500 r/min的轉速離心20 min，取上層液，過濾待測。

2.4 光譜數據采集

拉曼光譜：功率250 mW，波長設置為780 nm，積分時間30 s，分辨率為5 cm-1，積分5次求平均值。

液樣：樣品池中分別加入0.5 mL的OTR202、0.05 mL待測樣和0.5 mLOTR103并混合均勻，靜置15 min后采集拉曼信號。

農藥殘留氣質聯用：OV-101毛細管柱，程序升溫，柱子初溫80℃，保持5 min，升溫速率10℃/min，終溫250℃，保持15 min；氣化室溫度260℃；載氣為氦氣，流速1.5 mL/min，進樣量1 μL。

3 武夷茶中殘留的苯醚甲環唑SERS檢測

3.1 苯醚甲環唑的普通拉曼光譜和表面增強拉曼光譜

由圖1苯醚甲環唑標準溶液與乙腈溶液的SERS及普通拉曼光譜圖可知，苯醚甲環唑與乙腈溶液的普通拉曼光譜圖即b和d，在曲線走勢及出峰位置上大致相同，說明信號峰并非農藥殘留產生。苯醚甲環唑標準溶液的SERS（a）在加入表面增強劑OTR202以及OTR103之后，信號得到增強，出現特征峰。而乙腈溶液的SERS(c)并沒有出現特征峰。

圖1 拉曼光譜圖Fig.1 Raman spectrum

圖2 不同濃度苯醚甲環唑溶液的SERS圖Fig.2 SERS diagram of different difenoconazole concentrations

圖2為經過預處理之后的不同濃度苯醚甲環唑溶液的SERS圖，由上至下濃度分別為55 mg/mL，45 mg/mL，32 mg/mL，28 mg/mL，17 mg/mL，10 mg/mL，5 mg/mL，0 mg/mL。觀察SERS信號可知，SERS信號強度的大小受溶液濃度大小的影響很明顯，當溶液濃度變小時，SERS信號強度也變小，當溶液濃度為55 mg/mL，45 mg/mL，32 mg/mL時，曲線都出現幾個明顯的特征峰，當濃度降低時，特征峰已不再明顯，當濃度大小為5 mg/mL時，特征峰已不再出現，由此可知，SERS能夠檢出苯醚甲環唑特征溶液的極限濃度為10 mg/mL。

3.2 試驗條件的優化分析

不同的提取劑效果不同，在檢測武夷茶中苯醚甲環唑含量時通常用到的提取劑有乙醚、乙腈以及二氯甲烷。乙醚和二氯甲烷在提取農殘時會產生大量的共萃物，效果較差，而在使用乙腈作為提取劑時則不會出現這些情況。在使用SERS方法檢測茶葉中苯醚甲環唑的含量時，由于苯醚甲環唑是弱極性物質，因此在提取時不需加水，防止茶葉中的水溶性物質析出。

圖3 苯醚甲環唑提取液與標準溶液的SERS圖Fig.3 SERS diagrams of difenoconazole extraction solution and standard solution

由圖3苯醚甲環唑提取液SERS圖以及苯醚甲環唑標準溶液SERS圖可知，在苯醚甲環唑的提取液（a）中并未發現目標物質的信號峰，說明檢測結果可能被茶葉中的熒光物質干擾，使得目標峰并未出現。PSA作為目前市場上使用較多的凈化劑，具有較好的凈化效果，能夠將樣品中的有機酸等物質有效的去除。在不同PSA用量下，苯醚甲環唑的拉曼特征峰并未出現，說明拉曼信號受到茶葉基質的干擾較大。隨著PSA用量由25 mg一直升到75 mg時，譜圖的基線逐漸趨于平穩，漂移現象減弱，當用量為75 mg時，其譜圖與用量為50 mg時譜圖基本一致，說明PSA的最佳用量為50 mg。

相比于普通竹炭，納米竹炭具有多孔性等特性，吸附力較強且表面積更大。隨著NBC用量的增加，基線漂移現象逐漸減弱，當用量為25 mg及30 mg時，并未出現苯醚甲環唑的拉曼信號峰，而用量為35 mg時出，出現了苯醚甲環唑的特征峰。結果表明，NBC的最佳用量為35 mg。

3.3 茶葉中苯醚甲環唑農藥殘留的SERS檢測分析與預測

取經過處理過的茶葉樣品凈化液，放置到氮吹儀中經氮吹后用乙腈定容，定容完成后用氣質聯用儀進行真實值檢測，如表1茶葉中苯醚甲環唑含量氣質聯用檢測結果所示。

表1 茶葉中苯醚甲環唑含量氣質聯用檢測結果Table 1 GC-MS test results of difenoconazole in tea

在對采集到的光譜數據進行分析時，首先采用MSC（多元散射校正）、SNV（標準正態變量變換）以及一階二階導數進行預處理，在對處理之后的數據建立偏最小二乘（PLS）模型。由表2不同預處理方法建立的PLS模型結果可知，經過MSC和SNV預處理后所建的模型優于一階二階導數，而一二階導數處理后建立的模型又優于原始光譜，且SNV預處理方法效果較好。

表2 不同預處理方法建立的PLS模型結果Table 2 Results of PLS models built by different pretreatment methods

在驗證方法的準確性時要對不同濃度的苯醚甲環唑茶葉樣本進行檢測，茶葉樣本經前處理之后，采集三次拉曼信號并求得平均值，經SNV預處理后，采用PLS模型進行樣本預測并與農藥殘留氣質結果相比較，如圖3預測值與真實值所示，發現茶葉樣本中農藥殘留的預測回收率在90～105%之間，真實值與預測值誤差在-10～5%之間，誤差值在可允許的范圍之內，與化學分析方法結果相差不大，說明茶葉中苯醚甲環唑的含量檢測也可以通過該方法來完成。

表3 預測值和真實值Table 3 Predicted and true values

對樣本進行t檢驗，得到的結果如表4預測值與參考值樣本t檢驗結果所示，t取值為-0.435，取其絕對值發現遠遠小于t0.05,3=3.2565，則表明建立的方法可行，預測值與參考值之間相差不大。

表4 預測值與參考值樣本t檢驗結果Table 4 Results of forecast and reference values t test

4 結論

本文利用表面增強拉曼光譜（SERS）技術，探究了苯醚甲環唑農藥殘留在武夷茶中含量的光譜檢測方法。將苯醚甲環唑作為目標農藥，將農藥的標準溶液噴灑在茶葉樣本上，分析苯醚甲環唑標準溶液SERS的拉曼光譜峰。以乙腈為提取劑，優化NBC和PSA的量，尋找到最佳的用量。以苯醚甲環唑作為目標物質采用偏最小二乘法建立武夷茶中農藥殘留的預測模型，模型預測回收率為92%～105%，相對誤差最大值為5%，在允許的誤差范圍之內。最終的t檢驗結果表明利用偏最小二乘法建立的預測模型能夠很好的預測目標農藥的含量，與參考值之間的差值可忽略，滿足大規模苯醚甲環唑農藥殘留的檢測要求。對苯醚甲環唑標準溶液的最低檢出濃度為10 mg/mL，農藥殘留量滿足國家規定的殘留限量(GB 2763-2014，10 mg/mL)要求。

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