氘代同位素內(nèi)標(biāo)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定黃酒中的氨基甲酸乙酯

賈素中,歐 杰,王 婧,許 祿

上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院;上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海 201306

氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,EC)是發(fā)酵食品和酒精飲料中的一種自發(fā)生成的伴隨產(chǎn)物。研究表明，氨基甲酸乙酯是一種多位點(diǎn)致癌物，可導(dǎo)致淋巴癌、肺癌、肝癌和皮膚癌等疾病[1-4]，并且與乙醇混合會(huì)促進(jìn)其致癌性[3,4]。鑒于其具有致癌性，目前國(guó)際社會(huì)認(rèn)為EC是食品中繼黃曲霉毒素之后的又一重大問(wèn)題[2]。1974年，世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）將其列為2B類(lèi)致癌物。2007年3月，將EC從可能致癌物質(zhì)2B類(lèi)提高為2A類(lèi)[5]。在20世紀(jì)70、80年代，世界各國(guó)學(xué)者先后又在蒸餾酒（例如朗姆酒、威士忌、白酒等），發(fā)酵食品（腐乳、泡菜、醬油等），發(fā)酵酒精飲料（黃酒、啤酒、清酒）這些食品中檢測(cè)到了氨基甲酸乙酯[2]。1985年，加拿大的衛(wèi)生與防疫部門(mén)對(duì)酒精飲料中氨基甲酸乙酯含量制定了強(qiáng)制性限量標(biāo)準(zhǔn)。之后美國(guó)、英國(guó)、瑞士、韓國(guó)、日本等國(guó)家先后開(kāi)展了有關(guān)氨基甲酸乙酯的毒理學(xué)、暴露水平和危險(xiǎn)性評(píng)估的研究工作[6,7]。2002年聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)開(kāi)始重點(diǎn)監(jiān)控發(fā)酵食品中的氨基甲酸乙酯，并制定了國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定其含量不能超過(guò)20 μg/L[7,8]。中國(guó)雖然目前暫時(shí)還沒(méi)有對(duì)氨基甲酸乙酯做任何明確的限定標(biāo)準(zhǔn)，但是人們對(duì)氨基甲酸乙酯的關(guān)注卻日益增多[9]。為了更好的監(jiān)控我國(guó)黃酒中EC含量，適時(shí)開(kāi)發(fā)出一種操作比較簡(jiǎn)單、速度較快、高效的檢測(cè)方法就顯得非常重要了。

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于EC的檢測(cè)方法眾多，主要有二氯甲烷/氣相色譜-質(zhì)譜法（GC/MS）、固相微萃取/氣相色譜-質(zhì)譜法（GC/MS）[10-12]，氣相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[13-15]，二維或多維色譜穩(wěn)定同位素稀釋質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，氣相色譜/熱離子檢測(cè)器（GC/TSD）法，高效液相色譜結(jié)合熒光檢測(cè)器(HPLC-FLD)法[16-18]，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)、薄層色譜法[19]，也有免疫相關(guān)方法的研究[20]，但是未見(jiàn)在免疫相關(guān)方面的成熟應(yīng)用。

本文建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定黃酒中氨基甲酸乙酯的分析方法。該方法利用了液相色譜高效的分離能力和四級(jí)桿質(zhì)譜的高靈敏度的定量檢測(cè)能力，樣品前處理比較簡(jiǎn)單，采取直接進(jìn)樣的方式，簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確。并對(duì)方法的檢出限、線(xiàn)性、樣品加標(biāo)回收率及精密度等方法評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了研究，得到了較為滿(mǎn)意的結(jié)果。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 儀器與試劑

儀器：采用2695 Quattro Micro型液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Waters公司)；AR1140電子天平（精確到0.0001 g）(梅特勒-托利多儀器有限公司)；SK3-SB2200超聲波清洗器(必能信超聲（上海）有限公司)；0.22μm有機(jī)濾膜(上海安普科學(xué)儀器有限公司)；Milli-Q Reference超純水發(fā)生器(美國(guó)Waters公司)。

試劑：氨基甲酸乙酯(EC CAS:51-79-6純度99.9%(德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司)-18℃保存)；D5-氨基甲酸乙酯(D5-EC內(nèi)標(biāo)CAS:73962-07-9純度99.8%(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)-18℃保存)；甲醇、乙腈、甲酸、乙酸、乙酸銨(HPLC級(jí))；超純水:由Milli-Q超純水機(jī)提供。

不同種類(lèi)的黃酒樣品均在上海某超市購(gòu)買(mǎi)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備

用電子天平分別準(zhǔn)確稱(chēng)取EC和D5-EC各10.0 mg(精確到0.1 mg)于10 mL的棕色瓶?jī)?nèi)，用甲醇水溶液（v:v=25:75）定容至刻度線(xiàn)，分別配制成1000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，（-20℃保存，有效期為1個(gè)月）。再根據(jù)需要逐級(jí)稀釋到實(shí)驗(yàn)所需要的濃度。

1.3 檢測(cè)條件

1.3.1 LC的檢測(cè)條件 Waters SunFireTMC18色譜柱（2.1×50 mm column，3.5 μm）為分析柱，流動(dòng)相為甲醇(A)和0.1%的乙酸水溶液(B)，洗脫程序：25%A和75%B等梯度洗脫，流速為0.30 mL/min，柱溫為40℃，自動(dòng)進(jìn)樣量為10 μL。

1.3.2 MS的檢測(cè)條件 電噴霧離子源正離子模式（ESI+），檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM模式），毛細(xì)管電壓為3.00 kV；離子源溫度120℃；脫溶劑氣流速為600 L/h，脫溶劑溫度350℃，錐孔氣流速50 L/h，碰撞氣體為惰性氣體氬氣(Ar)，掃描方式為正離子掃描，駐留時(shí)間50 ms。

1.4 樣品的前處理

準(zhǔn)確量取1.00 mL黃酒置于10 mL容量瓶?jī)?nèi)，用甲醇-水溶液（v:v=25:75）定容至刻度線(xiàn)，然后加入一定量的內(nèi)標(biāo)D5-EC，振蕩器混勻。然后通過(guò)0.22 μm的有機(jī)濾膜，上機(jī)備用。

1.5 定性定量

采用自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10 μL，分別選擇m/z61.9和m/z62.9作為EC和D5-EC的定量離子，測(cè)定EC(m/z90.0/61.9)和D5-EC(m/z95.1/62.9)的峰面積，以二者的峰面積比值比與標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中EC的濃度(μg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)測(cè)定的樣品溶液中EC和D5-EC的峰面積比從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上得到樣品溶液中EC的濃度，從而可計(jì)算出樣品中EC含量(μg/L)[19]。以保留時(shí)間和EC標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定的m/z 61.9作為定性依據(jù)。在實(shí)際樣品測(cè)定EC時(shí)保留時(shí)間范圍小于±0.5 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

樣品中的EC若采取傳統(tǒng)的固相微萃取或者用有機(jī)溶劑液液萃取，不僅回收率低而且重現(xiàn)性較差。該方法采用直接進(jìn)樣的方式進(jìn)行分析，為了減少基質(zhì)效應(yīng)對(duì)被測(cè)組分EC的干擾，本實(shí)驗(yàn)采用對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尅Ｍㄟ^(guò)考察對(duì)樣品進(jìn)行1～15倍的稀釋?zhuān)l(fā)現(xiàn)隨著稀釋倍數(shù)的逐漸增大，基線(xiàn)較穩(wěn)，峰形較好，基質(zhì)效應(yīng)對(duì)樣品測(cè)定的影響逐漸變小（2～4倍響應(yīng)值最好），當(dāng)繼續(xù)稀釋時(shí)，被測(cè)組分濃度較低，基線(xiàn)不穩(wěn)，峰形開(kāi)始變差，響應(yīng)值較低。因此本文采用對(duì)黃酒樣品進(jìn)行2～4倍稀釋。

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.2.1 LC條件 為了得到較好的色譜圖和改善分離效果，對(duì)反相柱常用的有機(jī)流動(dòng)相（如乙腈、甲醇），常用的水相（如甲酸、乙酸、甲酸銨、乙酸銨溶液）進(jìn)行了分離和質(zhì)譜考察，分析色譜峰和離子化程度。結(jié)果表明甲醇-水的洗脫效果比較好，在甲醇-水流動(dòng)相體系中加入乙酸后發(fā)現(xiàn)不但可以獲得較高的分離度和靈敏度，進(jìn)一步分析0.1%和0.2%乙酸，發(fā)現(xiàn)加入0.1%的乙酸響應(yīng)值較高，所以本實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相體系選擇甲醇-水溶液（0.1%乙酸）。標(biāo)準(zhǔn)品EC和D5-EC的MRM模式下的色譜圖如下圖1。

圖1 EC（20 μg/L）和D5-EC（20 μg/L）標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of EC(20 μg/L)and D5-EC（20 μg/L）

2.2.2 MS條件 采用MRM模式采集EC和D5-EC的母離子及對(duì)應(yīng)的響應(yīng)比較好的子離子，EC和D5-EC的相對(duì)分子質(zhì)量都比較小，電離后只能選出一個(gè)特征離子作為定性和定量離子，EC和D5-EC的保留時(shí)間、母離子、子離子、以及錐孔電壓和碰撞能量等參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 EC和D5-EC的質(zhì)譜條件Table 1 MS-MS parameters for EC and D5-EC

將被測(cè)組分進(jìn)行全掃描檢測(cè)，得到一級(jí)質(zhì)譜圖，EC為m/z90.0，D5-EC為m/z95.1（如圖2和3），然后用惰性氣體Ar轟擊母離子，獲得其二級(jí)質(zhì)譜圖及其碎片離子。EC和D5-EC的二級(jí)特征離子分別為m/z61.9和m/z44，與m/z 62.9和m/z44，m/z44的碎片離子是由母離子脫去乙氧基形成的，其離子豐度較小，而m/z61.9和m/z62.9是由母離子脫羰基形成的，離子豐度很大。我們一般定量一個(gè)化合物時(shí)通常用2個(gè)子離子都能被觀(guān)察到，本實(shí)驗(yàn)所測(cè)的EC濃度很低時(shí)，m/z90.0/44信號(hào)很弱，但是m/z90.0/61.9的信號(hào)非常的強(qiáng)，特征非常明顯，因此可以對(duì)EC進(jìn)行檢測(cè)和定量分析。D5-EC在理化特性和色譜分離行為中具有與EC非常相似的表現(xiàn)，能夠更好地校正分析過(guò)程中各種因素對(duì)EC測(cè)定結(jié)果的影響，提高EC分析的回收率，使檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確、穩(wěn)定。目標(biāo)化合物相對(duì)分子比較小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，經(jīng)過(guò)質(zhì)譜碰撞分裂后只能得到一個(gè)比較明顯的特征碎片離子。我們根據(jù)母離子(m/z90.0和m/z95.1)及非常明顯的特征碎片離子(m/z61.9和m/z62.9)組成定性和定量離子對(duì)，同時(shí)根據(jù)保留時(shí)間以及離子豐度對(duì)目標(biāo)化合物EC進(jìn)行定性定量分析。

圖2 EC的一級(jí)質(zhì)譜掃描圖Fig.2 Full scan mass spectrum of EC

圖3 D5-EC的一級(jí)質(zhì)譜掃描圖Fig.3 Full scan mass spectrum of D5-EC

2.3 線(xiàn)性范圍與檢出限以及定量限

分別配制一系列不同濃度的EC標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為2，5，10，20，40，80，200，500 μg/L，D5-EC標(biāo)準(zhǔn)液20 μg/L按上述色譜-質(zhì)譜操作條件進(jìn)行測(cè)定，記錄標(biāo)準(zhǔn)溶液EC和D5-EC的響應(yīng)值，然后以EC和D5-EC的濃度比為橫坐標(biāo)，以EC和D5-EC的峰面積比為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸方程，獲得EC的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及相關(guān)系數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性關(guān)系和檢測(cè)限為:回歸方程Y=1.06х+0.147，R2=0.9922（х為EC和D5-EC的濃度比，Y為EC和D5-EC響應(yīng)比）以樣品分析中靠近EC色譜峰的基線(xiàn)噪音值，按信噪比S/N為3確定其檢測(cè)限（LOD）為1.8 μg/L，以S/N為10確定定量限(LOQ)為5.0 μg/L。

2.4 回收率和精密度

從市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)的三種酒樣各取250 mL經(jīng)過(guò)0.22 μm的有機(jī)濾膜過(guò)濾,經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋倍數(shù)后取1 mL備用，再分別添加10 μg/L、20 μg/L和100 μg/L氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，充分混合上機(jī)測(cè)定，每個(gè)添加水平測(cè)定6次，分別測(cè)定不同品牌的黃酒高低濃度的加標(biāo)回收率為88.9%～103.1%；考察方法精密度，EC含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，符合方法性能指標(biāo)的要求，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 黃酒中氨基甲酸乙酯回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）(n=6)Table 2 Recoveries and relative standard deviations(RSDs)of EC spiked in Chinese rice wine(n=6)

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

根據(jù)以上建立的方法，分別對(duì)市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)的10種黃酒樣品，每種樣品平行測(cè)定3次，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)的黃酒均檢出了一定含量的EC，當(dāng)年釀造黃酒中EC含量較低，陳釀黃酒中EC含量普遍偏高，并且陳釀時(shí)間越長(zhǎng)，其中的EC濃度越高。

表3 實(shí)際樣品中EC含量 (n=3)Table 3 Contents of EC in real samples(n=3)μg/L

3 結(jié)論

建立了以D5-氨基甲酸乙酯作內(nèi)標(biāo)物，利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法直接快速測(cè)定黃酒中氨基甲酸乙酯（EC）含量的方法。該方法能以高效的分析效率快速完成整個(gè)分析過(guò)程（10 min內(nèi)），與以往的方法比較大大縮短了分析檢測(cè)時(shí)間。且樣品經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單稀釋后直接進(jìn)樣，不需要濃縮、萃取以及凈化等復(fù)雜的前處理過(guò)程。該方法準(zhǔn)確、可靠、靈敏度高，方法重現(xiàn)性較好，能夠滿(mǎn)足酒類(lèi)產(chǎn)品中氨基甲酸乙酯的常規(guī)快速檢測(cè)。

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