人博卡病毒1型主要抗原NS1、NP1及VP1/2的抗體制備及應(yīng)用

劉文寬，游愛(ài)萍，許 多，邱淑燕，周志超，李 熾，周 榮

(呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣州醫(yī)科大學(xué)，廣東 廣州 510230)

人博卡病毒1型主要抗原NS1、NP1及VP1/2的抗體制備及應(yīng)用

劉文寬，游愛(ài)萍，許 多，邱淑燕，周志超，李 熾，周 榮

(呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣州醫(yī)科大學(xué)，廣東 廣州 510230)

人博卡病毒1型(human bocavirus 1，HBoV1)是全球流行的重要呼吸道病毒，其研究尚處于初期階段。通過(guò)原核表達(dá)的方式對(duì)HBoV1主要抗原NS1、NP1、VP1/2進(jìn)行蛋白表達(dá)，通過(guò)純化、免疫小鼠成功獲得3種蛋白的抗體血清，通過(guò)ELISA評(píng)價(jià)了抗體對(duì)相應(yīng)蛋白抗原及臨床HBoV1陽(yáng)性樣品的效價(jià)，并將所制備的抗體成功用于HBoV1廣州株GU338055反向遺傳系統(tǒng)的NS1、NP1、VP1/2的免疫熒光研究。結(jié)果表明，所制備抗體在1∶50稀釋度時(shí)A450值對(duì)陰性對(duì)照約有4倍提升，為HBoV1后續(xù)深入研究提供了重要工具，具有重要意義。

人博卡病毒1型；NS1；NP1；VP1/2；抗體；免疫熒光

人博卡病毒1型(human bocavirus 1,HBoV1)是Allander等[1]于2005年首次在下呼吸道感染患者中發(fā)現(xiàn)的，歸屬于細(xì)小病毒科、細(xì)小病毒亞科、博卡病毒屬。HBoV1粒子直徑為26 nm，基因組約5.5 kb，是一種體積較小、具有二十面體衣殼、無(wú)包膜的單鏈線(xiàn)性DNA病毒，末端為反轉(zhuǎn)重復(fù)序列(ITR)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，為病毒復(fù)制所必須。HBoV1由左端唯一啟動(dòng)子啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，其后續(xù)蛋白產(chǎn)生及成熟的詳細(xì)過(guò)程仍有待深入研究[2]。基因組序列、轉(zhuǎn)錄譜和表達(dá)譜分析表明，HBoV1主要表達(dá)2種衣殼蛋白(VP1和VP2)及2種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1和NP1)，其中，VP1、VP2長(zhǎng)度分別為672 aa、542 aa，具有典型的基因重疊區(qū)。VP1的N端為非重疊區(qū)，長(zhǎng)度為129 aa，即VP1獨(dú)特區(qū)(VP1-unique，VP1u)；后面為VP1和VP2的重疊區(qū)(VP1/2)，長(zhǎng)度為542 aa，序列完全相同[3]。

HBoV1是一種全球流行的重要呼吸道病毒，可引起上、下呼吸道感染[4-5]。研究表明，感染HBoV1后會(huì)導(dǎo)致分化的組織樣氣道上皮細(xì)胞(HAE)的纖毛減少、緊密連接破壞、細(xì)胞肥大，這些與肺損傷的組織變化非常相似[2]，在一定程度上解釋了HBoV1的致病機(jī)制。同時(shí)，HBoV1感染引起的氣道上皮細(xì)胞纖毛的減少和緊密連接的破壞可能導(dǎo)致人體對(duì)外部病原體的抗感染屏障遭到破壞，從而對(duì)其它病原體易感，在一定程度上解釋了HBoV1存在的高共感染率。這表明，HBoV1感染的影響可能不僅僅局限于自身疾病的產(chǎn)生，同時(shí)也導(dǎo)致其它病原體易感，其與AAV2/HBoV1形成的嵌合病毒有作為基因治療載體的潛質(zhì)[6]。

目前，HBoV1純病毒除在三維分化的組織樣呼吸道上皮細(xì)胞中能夠正常感染增殖外，無(wú)法通過(guò)常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)獲得，采用反向遺傳技術(shù)也只能獲得少量HBoV1純病毒[2]。所以，對(duì)HBoV1的研究還處于初級(jí)階段，對(duì)其病毒包裝、感染性及致病性的研究仍然迫切。

作者前期研究[5]中從一名60歲女性肺炎患者中獲得了HBoV1廣州株GU338055，在此對(duì)HBoV1主要抗原NS1、NP1、VP1/2進(jìn)行原核表達(dá)、純化，并通過(guò)免疫小鼠獲得其抗體，擬為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 HBoV1廣州株主要抗原NS1、NP1及VP1/2片段PCR擴(kuò)增

1.1.1 引物設(shè)計(jì)

對(duì)HBoV1廣州株主要抗原NS1(aa 640～781)、NP1(aa 1～219)、VP1/2(aa 369～475)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)，如表1所示。

表1 HBoV1廣州株主要抗原片段PCR擴(kuò)增引物

1.1.2 擴(kuò)增反應(yīng)

以前期獲得HBoV1廣州株時(shí)構(gòu)建的反向遺傳系統(tǒng)全長(zhǎng)質(zhì)粒作為模板，使用Ex Taq 50 μL體系(Takara)分別對(duì)NS1、NP1、VP1/2片段進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。

擴(kuò)增反應(yīng)體系：HBoV1廣州株核酸模板(質(zhì)粒)0.5 μL,10×Ex Taq buffer(Mg2+Plus)5 μL,dNTP mixture(各2.5 mmol·L-1)4 μL,正向引物(10 μmol·L-1)1.5 μL,反向引物(10 μmol·L-1)1.5 μL,Ex Taq(5 U·μL-1)0.5 μL,ddH2O補(bǔ)足至50 μL。

擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 變性15 s，52 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.1.3 擴(kuò)增產(chǎn)物純化

取2 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用TIANprep DNA gel extraction kit(天根生化科技(北京)有限公司)進(jìn)行目標(biāo)DNA的凝膠回收及純化。

1.2 原核表達(dá)載體構(gòu)建、蛋白表達(dá)及純化

1.2.1 原核表達(dá)載體構(gòu)建

利用pGEX-4T-3質(zhì)粒構(gòu)建HBoV1主要抗原原核表達(dá)載體pGEX-NS1、pGEX-NP1、pGEX-VP1/2。

(1)質(zhì)粒與純化的擴(kuò)增片段酶切

用SalⅠ和NotⅠ(NEB)分別對(duì)pGEX-4T-3質(zhì)粒及純化的NS1、NP1、VP1/2擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，于37 ℃水浴2 h，使用TIANprep DNA gel extraction kit進(jìn)行目標(biāo)DNA的凝膠回收及純化。

50 μL酶切體系：NE buffer 3.15 μL、酶切目標(biāo)核酸15 μL、SalⅠ 1 μL、NotⅠ 1 μL、ddH2O補(bǔ)足至50 μL。

(2)連接

使用T4 DNA ligase(NEB)分別連接酶切的pGEX-4T-3與NS1、NP1、VP1/2，構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-NS1、pGEX-NP1、pGEX-VP1/2，于16 ℃水浴2 h。

10 μL連接體系：T4 DNA ligation buffer 1 μL、pGEX-4T-3 酶切產(chǎn)物4 μL、NS1或NP1或VP1/2酶切產(chǎn)物4 μL、T4 DNA ligase 1 μL。

(3)轉(zhuǎn)化

使用E.coliTOP10感受態(tài)細(xì)胞(天根生化科技(北京)有限公司)轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物。步驟如下：冰上融化感受態(tài)細(xì)胞，吸取連接產(chǎn)物至感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30 min，42 ℃熱激45 s，迅速轉(zhuǎn)至冰浴2 min，加入無(wú)抗性L(fǎng)B培養(yǎng)基 500 μL至37 ℃搖床中250 r·min-1振蕩培養(yǎng)1 h，取200 μL涂布含氨芐青霉素LB(LB-Amp+)固體平板，于37 ℃培養(yǎng)箱中倒置過(guò)夜培養(yǎng)。

(4)驗(yàn)證

挑取平板上的單菌落至含0.8 mL LB-Amp+液體培養(yǎng)基的1.5 mL離心管中，37 ℃、250 r·min-1培養(yǎng)4～5 h，使用菌落PCR進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選，即用表1中各片段擴(kuò)增引物分別進(jìn)行驗(yàn)證。

菌落PCR條件：?jiǎn)尉渑囵B(yǎng)物0.5 μL、10×Ex Taq buffer(Mg2+Plus)2.5 μL、dNTP mixture(各2.5 mmol·L-1)1 μL、正向引物(10 μmol·L-1)1 μL、反向引物(10 μmol·L-1)1 μL、Ex Taq(5 U·μL-1)0.2 μL、ddH2O補(bǔ)足至25 μL。

驗(yàn)證反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性 15 s，52 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增片段。陽(yáng)性克隆每種蛋白，挑選2例測(cè)序驗(yàn)證。

使用AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒(Axygen)分別提取最終確認(rèn)正確的pGEX-NS1、pGEX-NP1、pGEX-VP1/2。使用0.5 μL提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞(天根生化科技(北京)有限公司)，方法同前。

1.2.2 蛋白表達(dá)及純化

(1)蛋白表達(dá)

用IPTG(Sigma)誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，通過(guò)調(diào)整IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度使目標(biāo)蛋白可溶。步驟如下：挑取pGEX-NS1、pGEX-NP1、pGEX-VP1/2陽(yáng)性E.coliBL21分別接種至5 mL LB-Amp+液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床中250 r·min-1振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；分別取4 mL培養(yǎng)物接種至400 mL LB-Amp+液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床中250 r·min-1振蕩培養(yǎng)3～4 h，加入IPTG進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)。3種蛋白的誘導(dǎo)條件分別為：pGEX-NS1，IPTG終濃度0.5 mmol·L-1、37 ℃、250 r·min-1誘導(dǎo)4 h；pGEX-NP1，IPTG終濃度0.2 mmol·L-1、20 ℃、250 r·min-1誘導(dǎo)16 h；pGEX-VP1/2，IPTG終濃度0.4 mmol·L-1、20 ℃、250 r·min-1誘導(dǎo)16 h。

(2)蛋白純化

破碎細(xì)菌：5 000 r·min-1離心15 min，收集菌體，加入20 mL PBS重懸細(xì)菌，冰上超聲(開(kāi)20 s、停5 s、功率70%)10～20 min破碎細(xì)菌至菌液變青色。4 ℃、10 000 r·min-1離心30 min，得上清。

純化樹(shù)脂準(zhǔn)備：將GST-Bind Resin(Novagen)親和純化樹(shù)脂重懸并吸取2 mL至50 mL離心管中，4 ℃、500×g離心5 min，吸棄上清；加入20 mL 預(yù)冷的PBS重懸樹(shù)脂洗去乙醇，4 ℃、500×g離心5 min，吸棄上清；加入1 mL 預(yù)冷的PBS重懸樹(shù)脂，備用。

純化：將破碎細(xì)菌上清液加至準(zhǔn)備好的純化樹(shù)脂中，室溫下輕搖30 min；轉(zhuǎn)移混合物至柱子中，注意樹(shù)脂中不要有氣泡；用15 mL 預(yù)冷的PBS洗柱子3次；用含還原性谷胱甘肽的洗脫液洗脫目標(biāo)蛋白；用10 kDa超濾管(Millipore)濃縮目標(biāo)蛋白；12% SDS-PAGE檢測(cè)目標(biāo)蛋白，Bradford法測(cè)定蛋白濃度。

1.3 小鼠免疫及效價(jià)評(píng)價(jià)

1.3.1 小鼠免疫

取100 μL目標(biāo)蛋白(50 μg)，用100 μL完全弗氏佐劑(Sigma)充分乳化，腹腔注射BALB/c 六周齡小鼠，總計(jì)4次免疫。免疫后取血清。

1.3.2 效價(jià)測(cè)定

用制備的抗原及臨床HBoV1陽(yáng)性樣品分別進(jìn)行ELISA抗體評(píng)價(jià)。將制備的抗原或臨床HBoV1陽(yáng)性樣品用包被液稀釋到4 μg·mL-1，酶標(biāo)板每孔加入100 μL,4 ℃包被24 h；棄孔中液體，用150 μL封閉液于37 ℃封閉2 h；棄孔中液體并洗滌5次，每次3 min；加入不同稀釋度的血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，以未免疫小鼠血清作為陰性對(duì)照，37 ℃放置30 min；用洗滌液滿(mǎn)孔洗滌5次,每次3 min；加入酶標(biāo)抗體(HRP-羊抗鼠)，37 ℃放置30 min；洗滌5次后，用TMB-過(guò)氧化氫尿素溶液底物反應(yīng)(Millipore)，37 ℃避光放置3～5 min,加入終止液顯色，測(cè)A450值。

1.4 抗體在HBoV1免疫熒光實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用

用所制備的抗體血清對(duì)電轉(zhuǎn)HBoV1反向遺傳系統(tǒng)全長(zhǎng)質(zhì)粒的AD293細(xì)胞進(jìn)行HBoV1的免疫熒光實(shí)驗(yàn)：用LONZA電轉(zhuǎn)試劑電轉(zhuǎn)質(zhì)粒至AD293細(xì)胞，電轉(zhuǎn)后培養(yǎng)在24孔板中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。用所制備抗體進(jìn)行其主要抗原NS1、NP1及VP1/2的免疫熒光檢測(cè)。步驟如下：24孔板中細(xì)胞用PBS浸洗3次，每次3 min；用4%多聚甲醛固定15～30 min，PBS浸洗孔3次，每次3 min；0.5%Triton X-100(PBS配制)室溫通透20 min，PBS浸洗孔3次，每次3 min；吸干PBS，在孔中加入正常10%山羊血清，室溫封閉30 min；吸棄封閉液，每孔加足夠量的稀釋(1∶50)制備一抗血清，以陰性小鼠血清作為陰性對(duì)照，濕盒中37 ℃放置1 h；PBST 浸洗孔3～6次，每次3 min；吸干孔中多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗(FITC-羊抗鼠)(聯(lián)科生物)，濕盒中37 ℃孵育1 h，PBST浸洗孔3次，每次3 min(注意：從加熒光二抗起，后面所有操作都盡量在較暗處進(jìn)行)；吸干孔中液體，用含抗熒光猝滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

2 結(jié)果與討論

2.1 HBoV1主要抗原片段原核表達(dá)載體構(gòu)建

通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得了主要抗原NS1、NP1及VP1/2的目標(biāo)片段(圖1)，利用pGEX-4T-3構(gòu)建了原核表達(dá)載體pGEX-NS1、pGEX-NP1、pGEX-VP1/2(圖2)，并最終通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證正確。

M.DNA marker

2.2 蛋白表達(dá)與純化

在不同誘導(dǎo)條件下，獲得了HBoV1 主要抗原NS1、NP1及VP1/2的目標(biāo)片段可溶性表達(dá)，通過(guò)GST親和層析，獲得了GST融合蛋白：GST-NS1(41.62 kDa)、GST-NP1(50.09 kDa)、GST-VP1/2(37.77 kDa)，濃度分別為188 μg·mL-1、523 μg·mL-1、373 μg·mL-1，如圖3所示。

M.DNA marker 1,4.pGEX-4T-3 2,3.pGEX-NP1 (其中3被證實(shí)為非目標(biāo)質(zhì)粒) 5.pGEX-VP1/2 6.pGEX-NS1

M.蛋白marker

2.3 免疫與抗體效價(jià)

通過(guò)免疫BALB/c小鼠，獲得一批免疫血清，分別使用蛋白抗原和臨床HBoV1陽(yáng)性樣品對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表2、3。

從表2可知，使用NS1、NP1、VP1/2蛋白抗原進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，與陰性小鼠血清對(duì)比，3種主要抗原的A450值升高2倍以上的稀釋度分別起始于1∶80 000、1∶40 000和1∶160 000。從表3可知，使用臨床HBoV1陽(yáng)性樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，與陰性小鼠血清對(duì)比，3種主要抗原的A450值在稀釋度為1∶50的情況下都約有4倍提升。

2.4 抗體在HBoV1免疫熒光實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用

以1∶50稀釋度的制備抗體作為一抗，以陰性小鼠血清作為一抗對(duì)照，以FITC-羊抗鼠作為二抗，用所制備的抗體對(duì)利用反向遺傳系統(tǒng)制備的HBoV1進(jìn)行主要抗原的檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。

表2 蛋白抗原ELISA檢測(cè)不同血清稀釋度下的A450值

注：設(shè)置3個(gè)平行復(fù)孔，數(shù)據(jù)為A450值mean±sd,下表同。

表3 臨床HBoV1陽(yáng)性樣品ELISA檢測(cè)不同血清稀釋度下的A450值

從圖4可以看出，相關(guān)抗原分布在細(xì)胞中。

2.5 討論

HBoV1是全球流行的重要呼吸道病毒，由于其無(wú)法在常規(guī)的呼吸道病毒培養(yǎng)細(xì)胞中培養(yǎng)分離，難以獲得純病毒，目前只發(fā)現(xiàn)在分化的組織樣呼吸道上皮細(xì)胞中能夠感染與增殖，未建立相應(yīng)的動(dòng)物模型，所以對(duì)其感染與致病機(jī)制還需更進(jìn)一步的研究。

圖4 所制備抗體對(duì)HBoV1主要抗原的免疫熒光檢測(cè)結(jié)果(200×) Fig.4 Immunofluorescence detection results of HBoV1 major antigens using prepared antibody(200×)

本研究針對(duì)HBoV1主要抗原NS1、NP1、VP1/2進(jìn)行抗體制備。利用pGEX-4T-3質(zhì)粒成功構(gòu)建了pGEX-NS1、pGEX-NP1、pGEX-VP1/2 GST融合表達(dá)載體。為了使目標(biāo)蛋白處于可溶狀態(tài)，保證親和層析的順利進(jìn)行，針對(duì)3種蛋白分別采用了不同的誘導(dǎo)條件，低溫低IPTG誘導(dǎo)條件保證了NP1、VP1/2的可溶性表達(dá)，純化效果較好；但NS1的純化效果相對(duì)較差，有較多的雜蛋白，雖然進(jìn)行了改進(jìn)，但效果不明顯。

本研究通過(guò)腹腔免疫小鼠獲得抗體血清，并分別利用目標(biāo)蛋白抗原和臨床HBoV1陽(yáng)性樣品評(píng)價(jià)抗體效價(jià)。在利用臨床HBoV1陽(yáng)性樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，3種血清在1∶50稀釋度時(shí)A450值均可獲得約4倍提升，滿(mǎn)足樣品后續(xù)的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用。

本研究以所制備的抗體作為一抗進(jìn)行了針對(duì)HBoV1廣州株反向遺傳系統(tǒng)電轉(zhuǎn)制備的病毒的免疫熒光檢測(cè)，獲得了良好的效果。

3 結(jié)論

針對(duì)HBoV1主要抗原NS1、NP1、VP1/2，通過(guò)原核表達(dá)的方式進(jìn)行蛋白表達(dá)，并通過(guò)純化、免疫小鼠成功獲得了3種蛋白的抗體血清，通過(guò)ELISA評(píng)價(jià)了抗體對(duì)相應(yīng)蛋白抗原及臨床HBoV1陽(yáng)性樣品的效價(jià)。結(jié)果表明，制備抗體在1∶50稀釋度時(shí)A450值對(duì)陰性對(duì)照約有4倍提升，并成功用于HBoV1廣州株GU338055反向遺傳系統(tǒng)的NS1、NP1、VP1/2的免疫熒光研究中。為HBoV1后續(xù)深入研究提供了重要的工具，具有重要意義。

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PreparationandApplicationofAntibodiesAgainstMajorAntigensNS1,NP1,andVP1/2ofHumanBocavirus1

LIU Wen-kuan,YOU Ai-ping,XU Duo,QIU Shu-yan,ZHOU Zhi-chao,LI Chi,ZHOU Rong

(StateKeyLaboratoryofRespiratoryDiseases,GuangzhouMedicalUniversity,TheFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510230,China)

Human bocavirus 1(HBoV1) is an important respiratory virus in the world,and its research is still at an early stage.We expressed the major antigens NS1,NP1,and VP1/2 of HBoV1 by prokaryotic expression,obtained successfully the antibody serums of three proteins by purification and immunization of the mouse,and evaluated the titers of antibodies by ELISA for the corresponding protein antigens and clinical HBoV1 positive sample.Meanwhile,the prepared antibodies were successfully applied in the immunofluorescence study of NS1,NP1,and VP1/2 of HBoV1 Guangzhou strain GU338055 reverse genetic system.The results indicated that,theA450values of the antibodies prepared at 1∶50 dilution were about 4 times higher than that of the negative control,which provided an important tool for the further study of HBoV1,and would be of important significance.

human bocavirus 1;NS1;NP1;VP1/2;antibody;immunofluorescence

國(guó)家自然科學(xué)基金(青年基金)項(xiàng)目(31500143)

2017-08-07

劉文寬(1982-)，男，安徽六安人，博士，助理研究員，研究方向：臨床病毒學(xué)，E-mail：ahlwk2000-2004@163.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.12.002

劉文寬，游愛(ài)萍，許多,等.人博卡病毒1型主要抗原NS1、NP1及VP1/2的抗體制備及應(yīng)用[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(12)：4-9.

R373 Q78

A

1672-5425(2017)12-0004-06