橙皮苷對TGF-β1誘導(dǎo)的人胚肺成纖維細(xì)胞活化的影響△

任周新，趙丹瑞，李麗，沈俊嶺，梅曉峰

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046；2.呼吸疾病診療與新藥研究河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450046；3.河南中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院兒科，河南 鄭州 450004；4.河南中醫(yī)藥大學(xué) 第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000)

·基礎(chǔ)研究·

橙皮苷對TGF-β1誘導(dǎo)的人胚肺成纖維細(xì)胞活化的影響△

任周新1，2*，趙丹瑞2，李麗3，沈俊嶺4，梅曉峰1

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046；2.呼吸疾病診療與新藥研究河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450046；3.河南中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院兒科，河南 鄭州 450004；4.河南中醫(yī)藥大學(xué) 第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000)

目的探討橙皮苷對TGF-β1誘導(dǎo)的人胚肺成纖維細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)的影響。方法12.5～200 μmol·L-1的橙皮苷作用于MRC-5細(xì)胞，得出不影響細(xì)胞增殖的劑量用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。5 ng·mL-1的TGF-β1作用于MRC-5細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞大量合成或分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分，同時(shí)用橙皮苷干預(yù)。結(jié)果12.5～50 μmol·L-1橙皮苷未發(fā)現(xiàn)顯著影響MRC-5細(xì)胞的增殖(P>0.05)。受到TGF-β1刺激后，MRC-5細(xì)胞的Col-I分泌量和α-SMA及FN的合成量均顯著增加(P<0.05)。12.5～50 μmol·L-1橙皮苷顯著減少上述分子的分泌量或合成量(P<0.05)。結(jié)論橙皮苷抑制TGF-β1誘導(dǎo)的人胚肺成纖維細(xì)胞合成或分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分。

橙皮苷；轉(zhuǎn)化生長因子-beta1；MRC-5細(xì)胞；活化

肺纖維化是多種彌漫性間質(zhì)性肺疾病的共同病理改變和最終結(jié)局，患者死亡率高，預(yù)后差。目前認(rèn)為肺成纖維細(xì)胞的增殖和活化導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的大量形成和堆積，是肺纖維化的重要病理機(jī)制。轉(zhuǎn)化生長因子β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)作為一種高效的刺激因子，體外能夠促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞分泌膠原蛋白、纖維黏連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分，成為體外肺成纖維細(xì)胞活化的常用誘導(dǎo)劑。先前的研究發(fā)現(xiàn)橙皮苷(hesperidin)能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的人肺泡上皮細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[1]，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的橙皮苷抑制大鼠的肝纖維化[2]，推測橙皮苷可能對TGF-β1介導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞的活化有影響，本研究即對該假設(shè)進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料

1.1 細(xì)胞

人胚肺成纖維細(xì)胞(MRC-5細(xì)胞，中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心)。MEM培養(yǎng)基(武漢博士德生物工程有限公司)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)。0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA液(胰酶，購于武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 藥物與試劑

橙皮苷(成都曼斯特生物科技有限公司，純度：99.70%)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑鹽(MTT)、人I型膠原(Collagen-I，Col-I)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒、人纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(生工Sangon BioteCh)；重組人轉(zhuǎn)化生長因子-β1(美國PeproTeCh Inc)；人alpha-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(Cloud-Clone Corp)。

2 方法

2.1 橙皮苷對MRC-5細(xì)胞增殖的影響

制備含有10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液作為完全培養(yǎng)液，用完全培養(yǎng)液制備MRC-5細(xì)胞的混懸液。3.0×103的MRC-5細(xì)胞加入到96孔板的板孔中，37 ℃、5%CO2條件培養(yǎng)24 h。吸出原培養(yǎng)液，加入含有不同濃度(12.5、25、50、100、200 μmol·L-1)的橙皮苷完全培養(yǎng)液，部分孔加入完全培養(yǎng)液作為正常對照。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，向每孔中加入20 μL含有5 mg·mL-1MTT的磷酸鹽緩沖鹽水，培養(yǎng)6 h后，吸出每孔的培養(yǎng)液，加入200 μL的二甲基亞砜，振蕩15 min，在490 nm波長，檢測各孔吸光度值(A)，按公式(1)計(jì)算抑制率。

(1)

2.2 TGF-β1刺激MRC-5細(xì)胞和橙皮苷的干預(yù)

在96孔培養(yǎng)板的每個(gè)孔中加入3.0×103細(xì)胞。將培養(yǎng)板放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，48 h取出培養(yǎng)板，吸棄孔中上清液，每孔加入不含血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)8 h。從每個(gè)孔中吸除培養(yǎng)液，立即加入新的培養(yǎng)液。分組如下：

正常組(加入完全培養(yǎng)液)；TGF-β1刺激組(簡稱TGF-β1組，加入含有5 ng·mL-1TGF-β1的完全培養(yǎng)液)；藥物干預(yù)組(除含有5 ng·mL-1的TGF-β1，還分別含有12.5、25 50 μmol·L-1的橙皮苷)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

2.3 Col-I的檢測

吸出每孔的培養(yǎng)液，1000 g、4 ℃離心10 min，按照試劑盒說明書檢測上清液中的Col-I的含量，結(jié)果以ng·mL-1表示。

2.4 FN和α-SMA檢測

用1×磷酸緩沖液(PBS)洗滌板孔3次，用0.25%胰酶消化貼壁細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)液，終止胰酶消化；1000 g、4 ℃離心10 min，棄去上清液；每管中加入1×PBS，振蕩，-80 ℃凍存；之后，取出，37 ℃融化，再凍存。如此5次，裂解細(xì)胞。最后一次涂片，顯微鏡下檢查無細(xì)胞。1000 g、4 ℃離心10 min，按照試劑盒說明書檢測細(xì)胞裂解液中的FN和α-SMA含量，結(jié)果以ng·mL-1表示。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 橙皮苷抑制MRC-5細(xì)胞的增殖

結(jié)果見圖1。100和200 μmol·L-1橙皮苷抑制MRC-5細(xì)胞的增殖(P<0.01)。

注 ：與對照組比較, **P<0.01。圖1 橙皮苷對MRC-5細(xì)胞增殖的抑制影響

3.2 橙皮苷抑制TGF-β1誘導(dǎo)的MRC-5細(xì)胞分泌α-SMA、Col-I和FN

結(jié)果見表1。與正常組比較，肺成纖維細(xì)胞受到TGF-β1刺激，合成、分泌FN和Co1-I以及α-SMA的能力增強(qiáng)(P<0.05)。與TGF-β1組比較，25、50 μmol·L-1的橙皮苷組的Co1-I和α-SMA分泌量顯著減少(P<0.05)；12.5、25、50 μmol·L-1的橙皮苷FN含量顯著減少(P<0.05)。

表1 橙皮苷抑制TGF-β1誘導(dǎo)的MRC-5細(xì)胞分泌α-SMA、Col-I和 /ng·mL-1

注：與TGF-β1組比較,*P<0.05。

4 討論

肺纖維化是一種死亡率較高的疾病，其特征性的病理組織改變是細(xì)胞外基質(zhì)的過量堆積，這些基質(zhì)成分包括膠原蛋白、纖維連結(jié)蛋白等。肺組織中的成纖維細(xì)胞受到某些刺激因子的誘導(dǎo)，異常增殖和異常的蛋白合成變化，大量合成與分泌多種基質(zhì)樣成分，成為細(xì)胞外基質(zhì)的主要來源。TGF-β1是一種重要的細(xì)胞因子，具有復(fù)雜的生物學(xué)活性。低氧、炎癥等刺激因素誘導(dǎo)肺局部組織異常增加TGF-β1的分泌，這些TGF-β1刺激肺成纖維細(xì)胞大量增殖，并向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后的肌成纖維細(xì)胞合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)的能力進(jìn)一步增強(qiáng)，其特征性的蛋白表達(dá)改變是α-SMA表達(dá)的異常增加。

TGF-β1刺激MRC-5細(xì)胞，α-SMA、FN的合成量和Col-I的分泌量增強(qiáng)。橙皮苷能夠顯著減少TGF-β1刺激的MRC-5細(xì)胞合成或分泌α-SMA、FN和Col-I，表明橙皮苷對肺成纖維細(xì)胞活化有一定的抑制作用。前期的研究發(fā)現(xiàn)橙皮苷抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[1]；肝星狀細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)證明，橙皮苷能夠抑制血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)誘導(dǎo)的TGF-β1 /Smad信號通路的活化[3]；另外發(fā)現(xiàn)橙皮苷的糖苷配基橙皮素抑制心肌細(xì)胞TGF-β/Smad信號通路的活化[4]，抑制Smad3的磷酸化[5]。上述結(jié)果提示，阻滯TGF-β/Smad信號通路可能是橙皮苷抑制肺成纖維細(xì)胞活化的機(jī)制。

[1] Yu H B，Li L，Ren Z X，et al.Inhibition of hesperidin on epithelial to mesenchymal transition of non-small cell lung cancer cells induced by TGF-β1[J].Indian J Pharm Educ Res，2016，50(4)：583-590.

[2] 吳芙蓉，李俊，任丹陽，等.橙皮苷抗大鼠肝纖維化作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，46(4)：358-361.

[3] 吳芙蓉，姜玲，何曉麗，等.橙皮苷對肝星狀細(xì)胞TGF-β1/Smad信號通路的影響[J].中國中藥雜志，2015，40(13)：2639-2643.

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EffectofHesperidinonProductionofα-SMA，Col-IandFNinHumanEmbryonicLungFibroblastStimulatedbyTGF-β1

REN Zhouxin1，2*，ZHAO Danrui2，LI Li3，SHEN Junling4，MEI Xiaofeng1

(1.HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine，Zhengzhou450046，China；2.CollaborativeInnovationCenterforRespiratoryDiseaseDiagnosisandTreatment&ChineseMedicineDevelopmentofHenanProvince，Zhengzhou450046，China；3.TheHospitalofHenanAcademyInstituteofTraditionalChineseMedicine，Zhengzhou450004，China；4.TheFirstAffiliatedHospitalofHenanUniversityofTraditionalChineseMedicine，Zhengzhou450000，China)

Objective：To study effect of hesperidin on product of extracellular matrix in human embryonic lung fibroblast stimulated by TGF-β1.Methods12.5-200 μmol·L-1hesperidin was cultured with MRC-5 cells，a sort of human embryonic lung fibroblast，aiming at finding dose extent of hesperidin without significant effect on cellular viability.MRC-5 cells were stimulated with 5 ng·mL-1TGF-β1 for increase production of extracellular matrix，at the same time，hesperidin was used with TGF-β1.Results12.5-50 μmol·L-1hesperidin was not significant effect on viability of MRC-5 cells(P>0.05).The dose of hesperidin was significantly decreased α-SMA，Col-I and FN levels (P<0.05).ConclusionHesperidin could inhibit production of extra cellular matrix in MRC-5 cells stimulated by TGF-β1.

Hesperidin；transforming growth factor-β1(TGF-β1)；MRC-5 cells；activity

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.9.011

2016年度河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目(16A360002)

*

任周新，高級實(shí)驗(yàn)師，研究方向：中醫(yī)藥研究與教學(xué)；E-mail：renzhouxin123@126.com

2016-11-30)