ADAM33基因T1位點多態性與內蒙古地區蒙、漢民族人群哮喘的相關性研究

朱淑芬 納仁高娃

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ADAM33基因T1位點多態性與內蒙古地區蒙、漢民族人群哮喘的相關性研究

朱淑芬1納仁高娃2

目的 探討解整合素-金屬蛋白酶33(ADAM33)基因T1位點(rs2280091)不同基因型及等位基因的分布頻率與內蒙古地區蒙、漢民族支氣管哮喘的關系。方法 選用限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)方法對漢族哮喘患者112例、蒙古族哮喘患者105例進行ADAM33基因多態性的檢測，并分別與110例健康漢族和108例健康蒙族進行比較，篩選有意義基因。結果 內蒙古地區蒙、漢族人群均可檢出T1位點3種基因型(AA、AG、GG),在蒙、漢族支氣管哮喘組分布頻率分別與健康對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)，漢族哮喘組AG、GG基因型OR值分別為0.183、 0.38，蒙古族哮喘組AG、GG基因型OR值分別為 0.295 、 0.851；蒙、漢族支氣管哮喘組T1位點等位基因A和G基因頻率分別與健康對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)，G等位基因OR值及95%可信區間分別為0.372(0.190-0.729)、0.237(0.111-0.509)。結論 內蒙古地區ADAM33基因T1位點基因多態性與內蒙古地區蒙、漢族人群哮喘發病可能相關。

解整合素-金屬蛋白酶33; 哮喘; 基因多態性; PCR-RFLP;蒙族；漢族

支氣管哮喘簡稱哮喘，是常見的慢性氣道疾病之一，因其發病機制復雜，涉及免疫、遺傳、環境等諸多因素，故在基因學角度，尋找易感基因至關重要。解整合素-金屬蛋白酶33(ADAM33)基因是近年來哮喘發病的研究熱點[1]。因此本課題使用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)技術，對內蒙古地區蒙、漢民族人群支氣管哮喘患者與ADAM33基因T1位點多態性關系進行研究，進一步從免疫遺傳學角度探討蒙、漢民族支氣管哮喘發病的遺傳學特征。

資料與方法

一、研究對象

選擇2014-2015年就診于內蒙古醫科大學附屬醫院門診及住院部的蒙古族、漢族支氣管哮喘患者(分別為105例、110例)為病例組，其中漢族哮喘組，男60例，女50例，最小年齡22歲，最大年齡80 歲，平均年齡(44±12.7)歲；蒙古族哮喘組，男54例，女51例，最小年齡17歲，最大年齡75歲，平均年齡(37±10.5)歲。收集病例均符合2008年中華醫學會呼吸分會哮喘學組修訂的哮喘診斷標準[2]。并選同期健康體檢的蒙、漢族人群(分別為108例、112例)作為對照，研究對象年齡、性別構成，比較差異無顯著性(P<0.05)。入選人員均符合祖籍三代及三代以上居住在內蒙古地區無血緣關系、無異族通婚史，無過敏性疾病病史，無高血壓、糖尿病等慢性基礎疾病、無腫瘤、自身免疫性疾病及其它家族性遺傳疾病的病史。

二、方法

1 基因組DNA提取:采患者外周靜脈血2mL，EDTA(INSEPACK，ST520EK)抗凝，采用全血基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN，DP348-02)提取DNA。

2 引物： T1位點(rs2280091)引物序列，上游引物: 5'-ACTCAAGGTGACTGGGTGCT-3'下游引物: 5'-GAGGGCATGAGGCTCACTTG-3，擴增片段長度大約為400bp，由上海生物工程公司合成。

3 PCR擴增：PCR反應體系總體系為20μL，包括：基因組DNA 1μL，Extaq Mix 10 μL，上、下游引物各1μL，ddH2O 7 μL；PCR 反應條件: 95 ℃預變性5 min，95℃ 變性20 s，68℃ 退火20s，72℃延伸30s，共35個循環，72℃終末延伸5min。PCR產物經2%瓊脂糖電泳檢測。

4 限制性片段長度多態性檢測: T1位點檢測使用限制性內切酶NcoI酶進行。酶切體系: 總體系為20μL，擴增的PCR反應產物10μL，限制性內切酶0.5μL，ddH2O 7.5μL，10×NEBuffer液2μL，37 ℃放置1小時；65℃放置20分鐘。酶切產物經3%的瓊脂糖凝膠進行電泳，電壓為120V，時間為30 min，然后放入凝膠成像儀中保存結果，進行圖像分析。

5 DNA序列測定:將擴增好的PCR片段送往上海英俊生物技術有限公司行DNA序列測定。

三、統計學方法

結 果

一、T1 位點的基因型檢測結果

1. T1位點突變類型為A/G。AA基因型：可被NcoI酶完全酶切，酶切產物片段長度分別為144bp和256bp；AG基因型：可被部分酶切，得到3個片段，長度分別為144bp、256bp和400bp，GG基因型：不可被酶切，產物長度為400bp，(見圖1)。

圖1 T1引物PCR產物NcoI酶切電泳圖

1泳道為Marker DL500， 2、5泳道為純合GG基因型；3、6泳道為純合AA基因型；4、7泳道為雜合AG基因型

2. T1位點基因測序，見圖2。

二、漢族哮喘與健康漢族人群比較

表1 漢族哮喘與健康漢族人群ADAM33基因T1位點基因型分布頻率和等位基因頻率比較[n(%)]

T1基因型及等位基因健康漢族(n=110)漢族哮喘(n=112)χ2POR95%CIAA79(71.82)104(92.85)1AG29(26.36)7(6.25)0.1830.076-0.440GG2(1.82)1(0.9)17.1760.0000.380.340-4.264A187(85.00)215(95.98)G33(15.00)9(4.02)15.6300.0000.2370.111-0.509

漢族哮喘組與健康漢族組的ADAM33 基因T1位點的基因型頻率、等位基因頻率兩組比較差異有統計學意義。

圖2 以上測序圖箭頭所示AA型.AG型.GG型

三、蒙古族哮喘與健康蒙族人群比較

蒙古族哮喘組與健康蒙古族組的ADAM33 基因T1位點的基因型頻率、等位基因頻率兩組比較差異有統計學意義。

四、健康蒙古族與健康漢族人群比較

表2 蒙古族哮喘與健康蒙族人群ADAM33基因T1位點基因型分布頻率和等位基因頻率比較[n(%)]

T1基因型及等位基因健康蒙古族(n=108)蒙古族哮喘(n=105)χ2POR95%CIAA80(74.07)94(89.52)1AG26(24.07)9(8.57)0.2950.130-0.665GG2(1.85)2(1.91)9.3430.0090.8510.117-6.180A186(84.93)197(93.81)G33(15.07)13(6.19)8.8270.0030.3720.190-0.729

表3 健康蒙古族與健康漢族人群ADAM33基因T1位點基因型分布頻率和等位基因頻率比較[n(%)]

T1基因型及等位基因健康蒙古族(n=108)健康漢族(n=110)χ2PAA80(74.07)79(71.82)AG26(24.07)29(26.36)GG2(1.85)2(1.82)0.1520.927A186(84.93)187(85.00)G33(15.07)33(15.00)0.0000.984

健康蒙古族與健康漢族人群各等位基因及基因型頻率比較，差異均無統計學意義。

五、漢族哮喘與蒙古族哮喘患者比較

蒙古族與漢族哮喘人群各等位基因及基因型頻率比較，差異均無統計學意義。

討 論

ADAM33的mRNA表達具有一定的組織特異性，主要表達于肺的平滑肌細胞和成纖維細胞，它可能與小氣道重塑、高反應性及炎癥等有關[3]。由于人類ADAM33基因的多態性、研究對象的人種、民族和地區差別以及實驗方法不同等原因，國內外研究報道不盡相同。

表4 漢族哮喘與蒙古族哮喘人群ADAM33基因T1位點基因型分布頻率和等位基因頻率比較[n(%)]

T1基因型及等位基因蒙古族哮喘(n=105)漢族哮喘(n=112)χ2PAA94(89.52)104(92.85)AG9(8.57)7(6.25)GG2(1.91)1(0.9)0.8630.649A197(93.81)215(95.98)G13(6.19)9(4.02)1.0630.302

最先發現哮喘與ADAM33基因T1位點具有強關聯的是Van Eerdewegh[4]等，隨后Young Ho Lee等在對亞洲人群ADAM33基因多態性進行分析，也發現T1位點與哮喘有關[5]。我國學者邱玉明[6]、Chiang[7]等發現T1 位點基因型頻率及等位基因分別在哮喘組和對照組中比較，差異均具有統計學意義。但Schedel和Werrner等[8-9]在德國人群中卻未發現T1位點與哮喘相關。我國皖南地區、廣州市兒童中也未發現 T1與哮喘有相關性[10-11]。目前在我國少數民族中，對新疆維吾爾族[12]及廣西壯族哮喘人群有所研究，發現哮喘均與T1的多態性相關，故不排除ADAM33基因多態性與地區、民族的差異有關，故本課題通過對內蒙古地區蒙、漢族人群進行ADAM33 T1基因型、等位基因分析，進一步闡述其與哮喘的相關性。

本項實驗首次對我國內蒙古地區漢族、蒙古族哮喘人群的ADAM33 基因T1位點進行了對比研究，對蒙、漢民族病例組和對照組T1位點的基因型和等位基因進行了統計，發現漢族與蒙古族健康人群及哮喘人群分布無統計學意義，及民族間無差異。但證實了ADAM33基因T1位點多態性與內蒙古地區蒙古族、漢族支氣管哮喘的發病率均具有相關性。對于T1位點，AA 為野生型、AG 為突變雜合子、GG 為突變純合子，在漢族哮喘組分布為104(92.85%)、7(6.25%)、1(0.9%), 在對照組分布為79(71.82%)、29(26.36%)、2(1.82%), χ2=17.176,P<0.05, 差異有統計學意義。漢族哮喘組ADAM33 基因T1位點等位基因A和G 的頻率分別為95.98%、4.02%; 對照組ADAM33 基因T1位點等位基因A 和G 分別為85%、15%。漢族哮喘組與對照組等位基因頻率比較差異有顯著性(χ2=15.630,P<0.05) 。在蒙古族哮喘組AA、AG及GG3種基因型分布為94(89.52%) 、9(8.57%) 、2(1.91%) , 在對照組分布為80(74.07%)、26(24.07%)、2(1.85%),χ2=9.343,P<0.01, 差異有顯著性。蒙古族哮喘組ADAM33 基因T1位點等位基因A和G 的頻率分別為93.81%、6.19%; 對照組ADAM33 基因T1位點等位基因A 和G的頻率分別為84.93%、15.07%。蒙古族哮喘組與對照組A 及G 等位基因頻率比較差異有顯著性(χ2=8.827,P<0.05) 。漢族哮喘組AG、GG基因型OR值分別為0.183、 0.38，蒙古族哮喘組AG、GG基因型OR值分別為0.295、0.851；蒙、漢族支氣管哮喘組，G等位基因OR值及95%可信區間分別為0.372(0.190-0.729)、0.23(0.111-0.509)，可見內蒙古地區蒙、漢族哮喘患者T1位點的基因型及等位基因多態性與哮喘發病相關，等位基因A可能為哮喘風險基因，等位基因G可能為保護基因。本實驗與國外很多學者及我國廣西壯族、臺灣地區等研究結果一致，但也與部分研究結果不同，考慮雖與地域、民族、種族差異有關，但不排除與所選樣本不同、檢測方法不同所引起，需擴大樣本進一步研究。

綜上所述, ADAM33 基因 T1位點多態性存在于內蒙古地區人群中，ADAM33 基因T1位點可能在中國內蒙古地區蒙古族、漢族哮喘人群中發揮作用。

[1] Sharma N,Tripathi P,Awasthi S,et al.Role of ADAM33 gene and associated single nucleotide polymorphisms in asthma[J].Allergy Rhinol (Providence),2011,2(2):e63-e70.

[2] 中華醫學會呼吸病學分會哮喘學組．支氣管哮喘的定義、診斷、治療和管理方案[J]．中華結核和呼吸雜志，2008，31(3)：177-185．

[3] Dijkstra A，Postma DS，Noordhoek JA，et al．Expression of ADAMs (“a disintegrin and metalloprotease”) in the human lung[J]．Virchows Arch，2009，454(4): 441-449．

[4] Van Eerdewegh P，Little RD，Dupuis J，et al． Association of the ADAM33 gene with asthma and bronchial hyperresponsiveness[J]．Nature，2002，418(6896): 426-430．

[5] Lee YH, Song GG． Association between ADAM33 T1 polymorphism and susceptibility to asthma in Asican [J]． Inflamm Res，2012，61(12)：1355-1362.

[6] 邱玉明，羅雅玲，賴文巖，等． ADAM33 基因 Met764Thr 位點多態性與支氣管哮喘發病機制及患者肺功能的相關性[J]．中華結核和呼吸雜志，2007，30(7)：518-521.

[7] Chiang CH，Lin MW，Chung MY，et al．The association between the IL-4，ADRb2 and ADAM 33 gene polymorphisms and asthma in the Taiwanese population[J]． J Chin Med Assoc，2012，75(12)： 635-643.

[8] Schedel M，Depner M，Schoen C，et al．The role of polymorphismsin ADAM33， a disintegrin and metalloprotease 33，in childh ood asthma and lung function in two German populations[J]．Respir Res，2006，7：91.

[9] Werner M，Herbon N，Gohlke H，et al．Asthma is associated with single-nucleotide polymorphisms in ADAM33[J]．Clin Exp Allergy，2004，34(1)：26-31．

[10] 金紀偉，姜玉新，劉文艷，等． IL-4R、IL-13、ADAM33基因多態性與中國皖南地區漢族人群支氣管哮喘的相關性研究[J]．中國免疫學雜志，2011，27(2)：135-143．

[11] 熊俊艷，何啟強，蔣卓勤，等． ADAM33基因 T1位點多態性與支氣管哮喘發病的相關性[J]．實用兒科臨床雜志，2009，24(16)：1241-1243．

[12] 米合熱古力·司馬義，胡昕，王晶，等.解整合素-金屬蛋白酶33基因F1、L1、T1位點多態性與維吾爾族成人哮喘的相關性研究[J]．新疆醫科大學學報，2016，39(3):257-260.

Association between polymorphism of T1 locus allele in ADAM33 gene and bronchial asthma in Inner Mongolia Han and Mongolian population

ZHUShu-fen,NARENGao-wa

DepartmentofICU,ZhongnanHospitalofWuhanUniversity,Wuhan,Hubei430071,China

Objective To explore the association of the polymorphism of T1 locus allele (rs2280091) in recombinant A disintegrin and metalloprotease 33 ADAM33 gene with bronchial asthma in Inner Mongolia Han and Mongolian population. Methods 112 screened Han population patients with asthma (the asthma group A) and 110 unrelated healthy Han population (the healthy control group A) were selected. 105 screened Mongolian population patients with asthma (the asthma group B) and 108 unrelated healthy Mongolian population (the healthy control group B) were selected. Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) was used to determine polymorphism of T1 locus allele in ADAM33 gene in all groups. Results Three genotypes (AA, AG and GG) were found in Inner Mongolia Han and Mongolian population. The differences of distribution frequency in the Mongolia, Han bronchial asthma groups were significant while compared with the control group (P<0.05). The OR value of AG and GG genotype was 0.183 and 0.38 in the asthma group A, and 0.295 and 0.851 in the asthma group B. There were significant differences in T1 gene frequency loci alleles A and G between the bronchial asthma groups and the control group (P<0.05). The OR value and the 95% confidence of G allele interval was 0.372 (0.190-0.729) in the asthma group B, and 0.237 (0.111-0.509) in the asthma group A. Conclusion T1 ADAM33 gene locus gene polymorphism is associated with asthma in Inner Mongolia Han and Mongolian population.

ADAM33; asthma; gene polymorphism; polymerase chain restriction fragment length polymorphism; Mongolian nationality; Han nationality

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.01.018

內蒙古自治區自然科學基金(No 2014MS08122)

1. 010050 內蒙古 呼和浩特，內蒙古醫科大學附屬醫院重癥醫學科

2. 010050 內蒙古 呼和浩特，內蒙古醫科大學

2016-06-20]