紫花苜蓿MsLEA4-4基因的克隆、表達分析及遺傳轉化

賈會麗，王學敏，郭繼承，高洪文，吳欣明，劉建寧，石永紅，董寬虎，王運琦*

(1.山西省農業科學院畜牧獸醫研究所，山西 太原 030032；2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193；3.北京綠京華園林工程有限公司，北京 102209；4.山西農業大學動物科技學院，山西 太谷 030801)

紫花苜蓿MsLEA4-4基因的克隆、表達分析及遺傳轉化

賈會麗1，王學敏2，郭繼承3，高洪文2，吳欣明1，劉建寧1，石永紅1，董寬虎4，王運琦1*

(1.山西省農業科學院畜牧獸醫研究所，山西 太原 030032；2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193；3.北京綠京華園林工程有限公司，北京 102209；4.山西農業大學動物科技學院，山西 太谷 030801)

胚胎晚期富集蛋白(LEA)廣泛參與植物對多種逆境脅迫的反應。本研究利用同源克隆的方法，從紫花苜蓿中克隆了一個LEA4類基因的開放閱讀框(ORF)，命名為MsLEA4-4。該基因編碼512個氨基酸，結構分析顯示MsLEA4-4包含5個重復的由11個氨基酸TAQAAKEKTQQ組成的序列特征。利用實時熒光定量PCR檢測了MsLEA4-4在不同逆境下的表達量，結果顯示,該基因受干旱、NaCl、Cu2+、Zn2+和外源ABA誘導表達上調，其中NaCl脅迫2 h、Cu2+和Zn2+脅迫8 h，MsLEA4-4基因表達量最高；冷脅迫和干旱脅迫下，該基因的表達量隨處理時間的延長呈逐漸上升趨勢，表明該基因可能參與了紫花苜蓿的抗逆性調控。構建植物超表達載體pCAMBIA3301-MsLEA4-4，采用農桿菌介導法侵染擬南芥花序，通過草銨膦(PPT)篩選和分子檢測，7株抗性苗呈陽性，表明目的基因已成功導入擬南芥基因組中。本研究為進一步探索MsLEA4-4基因在紫花苜蓿抗逆性調控中的作用奠定了基礎。

紫花苜蓿；胚胎晚期富集蛋白(LEA)；逆境脅迫；遺傳轉化

由于植物的不可移動性，在生長發育過程中往往會遭受干旱、高溫、低溫、高鹽等各種非生物脅迫，這些脅迫都會引起植物內部的水分缺失。缺水會引起植物體內的呼吸作用和光合作用等一系列生理活動失調[1]。在長期的進化過程中，植物演化出一系列從細胞到生理水平的應答反應，如基因的表達、代謝的調節、酶活性的改變等，來提高自己對不良環境的耐受性[2]。胚胎晚期富集蛋白(late embryogenesis abundant，LEA)是參與細胞抗逆保護的一類重要蛋白，可阻止干旱導致的蛋白質聚集，從而提高植物耐旱性；在低溫脅迫下，LEA蛋白的合成可保護生物膜，提高植物的抗寒性；LEA蛋白還可通過穩定細胞膜，隔離或結合離子的方式降低滲透壓，減少植物在高滲、高鹽條件下導致的細胞脫水和結構破壞等[3]。LEA蛋白不僅在植物發育晚期的種子中大量積累，在受到水分脅迫(干旱、鹽、低溫等)的營養組織中，LEA蛋白也可被誘導表達[4]。因此，LEA蛋白的表達與植物細胞抗逆保護作用有著密切聯系。近年來，有諸多研究證明LEA基因的過量表達可以增強轉基因植物的脅迫抗性[5]。鄒永東等[6]將大豆(Glycinemax)LEA1蛋白轉入擬南芥(Arabidopsisthaliana)中，發現轉基因擬南芥的耐鹽性有所提高。趙詠梅等[7]將小麥(Triticumaestivum)LEA2基因轉入擬南芥中，發現轉基因擬南芥的耐鹽性和耐旱性明顯提高。Dalal等[8]發現在干旱、滲透脅迫、高鹽以及外源ABA脅迫下SbLEA3的表達量升高，SbLEA3參與高粱(Sorghumbicolor)體內的逆境調控。白永琴[9]將紫花苜蓿(Medicagosativa)LEA3-1基因轉入煙草(Nicotianatabacum)中，240 mmol/L NaCl脅迫下轉基因植株體內丙二醛含量、電導率與對照相比明顯降低，說明轉LEA3-1蛋白提高了轉基因煙草的耐鹽性。Amara等[10]將第5組LEA蛋白Rab28轉入玉米(Zeamays)中，增強了轉基因植株的耐旱性，滲透脅迫下轉基因植株的葉面積和根面積增加，葉綠素含量降低緩慢，丙二醛含量降低。LEA4蛋白在植物界中也普遍存在，目前已經從玉米[11]、大豆[1]等多種植物中克隆到了LEA4基因，轉化擬南芥后發現轉基因植株的抗鹽性和耐旱性明顯提高。總之，目前對LEA1～3類蛋白保護功能的研究已積累了較多資料，如LEA基因的表達模式、細胞學定位、轉基因植物研究、蛋白質特性分析等[12]，但對LEA4蛋白的研究相對較少，其功能和作用機制仍然不清楚。

紫花苜蓿營養價值高，適口性好，且具有抗寒、耐鹽堿等優良特性，在家畜日糧和土壤改良中發揮著重要角色[13]。近年來，畜牧業結構的調整和轉型升級加快了草食畜牧業的發展，對優質安全草食畜產品的需求推動著紫花苜蓿在品種改良和抗性育種方面的研究越來越深入[14]。本研究從紫花苜蓿中成功克隆出LEA4類基因MsLEA4-4，對其進行生物信息學分析，并研究在不同逆境脅迫下MsLEA4-4的表達模式，同時構建超表達植物載體，將MsLEA4-4基因轉入擬南芥中，為深入研究MsLEA4-4基因在紫花苜蓿中的抗逆機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

紫花苜蓿“中苜1號”為中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所育成品種。DNA聚合酶Ex Taq、DNA Makers、pMD18-T Vector、限制性內切酶、T4DNA連接酶均購自Takara公司(日本)；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit購自Fermentas(美國)，Trizol試劑購自Invitrogen(美國)，SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit和In-Fusion? HD Cloning Kit均購自Clontech(美國)，ABA購自Sigma(美國)，大腸桿菌感受態細胞EscherichiacoliDH5α購自北京天根生化科技有限公司。ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、氯仿、異丙醇、乙醇、NaCl、PEG6000等均為國產分析純試劑。

1.2 實驗方法

1.2.1材料的種植與處理 2014年4月將100粒紫花苜蓿中苜1號種子用氯氣消毒24 h后播種于鋪有濾紙的培養皿上，置于25 ℃光照培養箱內發芽，待長出2片子葉后移至營養缽中(蛭石∶珍珠巖=3∶1)，培養4 周后選取長勢一致的苜蓿幼苗進行干旱、高鹽、低溫和脫落酸脅迫人工模擬環境處理，每個處理5株，重復3次。干旱處理：將紫花苜蓿幼苗置于20% PEG6000的1/2 MS營養液中，室溫25 ℃條件下將植株分別處理0，2，4，8，12和24 h；高鹽處理：將紫花苜蓿幼苗置于含有250 mmol/L NaCl的1/2 MS營養液中，室溫25 ℃條件下分別處理0，2，4，8，12和24 h；冷處理：將紫花苜蓿幼苗置于1/2 MS營養液中，4 ℃條件下分別處理0，2，4，8，12和24 h；Zn2+處理和Cu2+處理：將紫花苜蓿幼苗分別置于含有500 μmol/L ZnSO4·7H2O和500 μmol/L CuSO4·5H2O的1/2 MS營養液中，室溫25 ℃條件下分別處理0，2，4，8，12和24 h。ABA處理：將紫花苜蓿幼苗置于含有0.1 mmol/L ABA的1/2 MS營養液中，室溫25 ℃條件下分別處理0，2，4，8，12和24 h。以上處理分別取其葉，-80 ℃下保存備用。

1.2.2紫花苜蓿MsLEA4-4基因的克隆與生物信息學分析 用Trizol法分別提取250 mmol/L NaCl溶液處理2，4，8，12和24 h后的幼葉總RNA后，按照質量比為1∶1∶1∶1∶1混合均勻。參照RevertAidTMFirst Strand cDNA Asynthesis Kit說明書，將不同處理下提取的RNA進行混合后反轉錄成cDNA，采用RACE-PCR方法進行擴增。根據轉錄組測序得到的類LEA蛋白Unigene序列(未發表)，分別設計5′RACE和3′RACE的特異性引物GSP1和GSP2，PCR擴增出兩端序列，經PMD18-T載體連接，陽性克隆送英駿公司(上海)測序，最后將測序所得3′端和5′端序列拼接，獲得全長cDNA序列。

用DNAStar 7.0分析MsLEA4-4基因的核酸及氨基酸序列，用ScanProsite 對MsLEA4-4基因進行功能預測。從NCBI上下載其他植物的LEA蛋白序列，用DNAMAN 6.0進行多序列比對；下載蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)LEA蛋白序列，利用MEGA 5.0軟件Neighbor-Joning法構建系統進化樹。

1.2.3不同逆境脅迫下紫花苜蓿MsLEA4-4基因的表達特異性 用Trizol試劑分別提取1.2.1中獲得的各處理RNA，根據RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis試劑盒說明書分別反轉錄為cDNA。參考 TaKaRa公司的SYBR System(ABI，美國)，采用兩步法進行Real-time PCR擴增，第1步：95 ℃預變性30 s；第2步：95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環。每次實驗3個樣品，每個樣品3次重復。基因特異引物為F1/R1，以紫花苜蓿ACT2基因為內參基因，引物為F2/R2。根據得到的Ct值，將每種處理的0 h設為對照，2，4，8，12和24 h分別設為5個不同處理，利用2-△△ct法[15]，分別計算MsLEA4-4基因在不同處理下的表達量。

1.2.4構建植物表達載體 分別設計含有BglⅡ和BsteⅡ 酶切位點的引物F4和R4(表1)，用該引物擴增MsLEA4-4的ORF序列，得到帶有酶切位點的目的基因片段；用BglⅡ和BsteⅡ雙酶切該目的基因片段和pCAMBIA3301 質粒載體，經 T4 DNA 連接酶連接，得到插入目的基因的pCAMBIA3301-MsLEA4-4植物超表達載體(圖1)，轉化E.coliDH5α 感受態細胞，挑選測序正確序列用于后續試驗。

1.2.5農桿菌轉化及篩選 提取測序正確的pCAMBIA3301-MsLEA4-4質粒，使用凍融法轉入農桿菌菌株GV3101。采用花序侵染法轉化擬南芥，在含草銨膦(PPT, 50 mg/L)的1/2 MS固體培養基上篩選轉基因抗性植株，使用PCR和RT-PCR法分別在基因組水平和轉錄水平對轉基因植株進行檢測。重復此篩選步驟至獲得T3代轉基因植株并用于后期脅迫處理試驗。將獲得的轉基因植株在含有NaCl(濃度分別為0、50、100、150、200、250、300 mmol/L)的1/2 MS培養基中生長1周后比較T3轉基因植株和野生型擬南芥植株的生長情況。

實驗中用到的所有引物用Primer Premier 5.0軟件設計，引物序列見表1。

表1 實驗中的引物序列Table 1 Primer used in the study

注：表中下劃線表示限制性酶切位點。

Note： Underlined nucleotides indicate the restriction site.

圖1 pCAMBIA3301-MsLEA4-4植物超表達載體構建Fig.1 Sketch map of over-expression vector of MsLEA4-4

2 結果與分析

圖2 紫花苜蓿MsLEA4-4 ORF及載體酶切鑒定結果Fig.2 PCR results of MsLEA4-4 ORF and constructed vector enzyme digestion a：紫花苜蓿MsLEA4-4 ORF電泳Electrophoresis result of the MsLEA4-4 ORF； M: DNA Marker 2000; 1: MsLEA4-4 ORF 片段 The fragment of MsLEA4-4 ORF.b:植物超表達載體pCAMBIA3301-MsLEA4-4酶切鑒定Enzyme digestion of over-expression vector pCAMBIA3301-MsLEA4-4；M: DNA Marker 2000；2: BglⅡ/BstEⅡ雙酶切3301-MsLEA4-4 double enzyme digestion of over-expression vector pCAMBIA3301-MsLEA4-4.

2.1 紫花苜蓿MsLEA4-4基因的克隆

根據高通量測序得到的225 bp類LEA Unigene片段，利用RACE-PCR技術，得到3′端長度為665 bp，5′端長度為498 bp的序列。利用DNAMAN 6.0軟件對所得到的序列進行拼接后，得到長為613 bp的ORF序列，見圖2a。 利用NCBI中的BLAST功能進行序列比對，結果顯示該序列與鷹嘴豆(Cicerarietinum)等物種的LEA基因高度同源，初步認為獲得的序列是一個LEA類蛋白序列。

2.2 紫花苜蓿MsLEA4-4基因的生物信息學分析

該序列含有一個498 bp的開放閱讀框，編碼166個氨基酸。序列編碼的蛋白質分子量為17.81 kDa，理論等電點為8.74，其中包含25個強堿性氨基酸(K、R)，23個強酸性氨基酸(D、E)，33個疏水性氨基酸(A、I、L、F、W、V)，61個極性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)。該蛋白缺少半胱氨酸(W)和色氨酸(C)，富含甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸、精氨酸以及蘇氨酸等，有5個重復的由11個氨基酸序列TAQAAKEKTQQ組成的序列特征(圖3)。

利用GenBank上的BlastP搜索到來源于不同物種的9個LEA蛋白序列，并進行了比對分析。圖3中可見，該基因編碼蛋白與其他物種中LEA蛋白的同源性相對較高，與蒺藜苜蓿同源性達96%，與擬南芥、野生大豆(Glycinesoja)、鷹嘴豆、地三葉(Trifoliumsubterraneum)等同源性達52%～82%。

將該基因與蒺藜苜蓿中LEA基因家族進行聚類分析，發現與蒺藜苜蓿LEA4-4聚為一類，屬于第4組LEA蛋白(圖4)。說明該基因可能具有LEA4-4蛋白的功能，將其命名為MsLEA4-4。

圖3 MsLEA4-4氨基酸序列與其他植物LEA蛋白的多序列聯配Fig.3 Multiple alignment analysis of MsLEA4-4 with homologous from other plants 方括號為5個重復的TAQAAKEKTQQ序列。Square brackets are five repetitive sequences of TAQAAKEKTQQ.Ms：紫花苜蓿 Medicago sativa；Mt：蒺藜苜蓿 Medicago truncatula；Ts：地三葉 Trifolium subterraneum；Ca：鷹嘴豆 Cicer arietinum；Cc：木豆 Cajanus cajan；Ah：花生 Arachis hypogaea；Va：赤豆 Vigna angularis；Gs：野生大豆 Glycine soja；Cj：錦雞兒 Caragana jubata；At：擬南芥 Arabidopsis thaliana.

圖4 蒺藜苜蓿LEA家族DNA序列系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of LEA DNA in M. truncatula

2.3 逆境脅迫下紫花苜蓿MsLEA4-4基因的表達分析

利用qRT-PCR對紫花苜蓿MsLEA4-4基因在非生物逆境脅迫下的表達量進行了檢測。結果顯示，多種逆境脅迫均能誘導紫花苜蓿MsLEA4-4基因的增強表達。在干旱(PEG模擬)、鹽(NaCl)、重金屬(Cu2+處理、Zn2+處理)脅迫誘導下，MsLEA4-4的表達量上調。其中干旱脅迫下該基因的表達量上調最顯著，處理8 h表達量為對照的189倍，處理24 h的表達量達到對照的1065倍(圖5A)；NaCl脅迫下，MsLEA4-4基因的表達量在8 h之前無明顯變化，8 h表達量為對照的16倍，接著又降低到與對照的表達量基本一致，24 h的表達量又逐漸上升為對照的35倍(圖5B)；Cu2+脅迫下，MsLEA4-4基因的表達量隨處理時間變化呈單峰趨勢，在8 h表達量達到最大，為對照的35倍(圖5C)；Zn2+脅迫下，MsLEA4-4基因的表達量在12 h之前基本無變化，在處理時間達24 h時表達量突然上升，但是變化也不大，為對照的15倍左右(圖5D)；冷(4 ℃)脅迫下MsLEA4-4基因的表達量呈現出先升高后降低的趨勢，在2 h表達量達到最大，接著就迅速下降，2 h后表達量均低于對照(圖5E)；外源ABA也能明顯誘導MsLEA4-4基因的表達，隨誘導時間的變化表達量逐漸上升，處理24 h時表達量達到最大，為對照的85倍(圖5F)。

圖5 不同脅迫下MsLEA4-4基因的表達量分析Fig.5 Gene expression analysis of MsLEA4-4 in response to different stress 圖中所有數據均重復3次，進行方差分析，**為極顯著差異。All data are repeated three times in the Figure， analysis of variance， ** is extremely significant difference.

2.4 紫花苜蓿MsLEA4-4基因轉化擬南芥

本研究將來自紫花苜蓿的MsLEA4-4 cDNA全長片段通過農桿菌介導的遺傳轉化方式導入模式植物擬南芥中進行超量表達。首先將MsLEA4-4 cDNA全長片段克隆到植物雙元表達載體pCAMBIA3301中(圖1)。通過限制性內切酶BglⅡ/BstEⅡ雙酶切檢測，獲得與預期大小相符613 bp左右的條帶(圖2b)。再將酶切陽性的克隆測序檢測，插入序列完整、無缺失、無突變，表明MsLEA4-4基因已經成功克隆到植物表達載體中。通過草銨膦篩選后， 提取T2代轉基因植株DNA， 分別用nptⅡ和MsLEA4-4引物進行PCR檢測，最終篩選出7株含有MsLEA4-4基因的陽性苗(圖6)，可用于后續MsLEA4-4基因功能驗證實驗。

圖6 轉基因植株PCR檢測Fig.6 Detection of transgenic plants by PCR

3 討論

LEA蛋白最早發現于棉花(Gossypiumhirsutum)子葉中，因其在植物胚胎發育后期大量表達而得名[16]。根據蛋白質序列同源性及其特殊的基元序列，Battaglia等[17]將LEA蛋白分為7個不同的類群。研究發現，不同LEA蛋白都具有高親水性和熱穩定性，缺少半胱氨酸和色氨酸，并富含甘氨酸或其他氨基酸類(如丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)[18]。LEA蛋白在植物中是個數量龐大的家族，LEA基因家族系統進化分析最先在擬南芥中被報道，其共有51個成員，被劃分為7類[19]，隨后在水稻(Oryzasativa)[20]、大豆[21]、黃瓜(Cucumissativus)[22]、玉米[23]中發現分別含有34、35、78和32個LEA蛋白，近年來又在蒺藜苜蓿[24]中發現含有23個LEA蛋白。紫花苜蓿和蒺藜苜蓿為近緣物種，因此本研究以模式植物蒺藜苜蓿中LEA蛋白為參考基因，對MsLEA4-4基因進行聚類分析，發現MsLEA4-4與蒺藜苜蓿LEA4-4聚在一起，歸屬于LEA4類。因此MsLEA4-4可能具有與LEA4類蛋白相似的功能。

ABA在植物逆境脅迫響應過程中發揮著信號分子的作用。LEA蛋白作為重要的逆境蛋白之一，可能會通過ABA信號途徑來調控植物的耐逆性[25]。這是因為LEA基因的啟動子區域一般含有ABREs元件，這種順式作用元件可以通過核心基序(ACGT)與轉錄因子相結合，來起始ABA響應基因的轉錄[26]。除了ABREs元件外，LEA基因的啟動子區域中還有富含AT序列的ATHB基序(CAATTATTA)，它能與ABA信號途徑中的調控因子相互作用來調控相關基因的表達。此外，在LEA基因啟動子區域還含有能被ABA誘導的胚特異性表達的DPBF基序(ACACNNG)等[3]。本研究發現在外源ABA誘導下，MsLEA4-4基因的表達量在24 h明顯上升，達到對照的85倍，說明MsLEA4-4對外源ABA的作用比較敏感，有可能會通過體內的ABA信號途徑來參與紫花苜蓿的抗逆性調控。

LEA蛋白在植物應對外界壓力的過程中扮演著重要的角色[27]。過去的許多研究已經報道了一些LEA蛋白與植物抗逆性相關的功能。例如，LEA基因的過量表達可以增強轉基因植物的脅迫抗性[28]。LEA蛋白最常見的功能是參與植物對干旱的響應過程[29]，這是因為LEA基因的啟動子區域上都具有一些與干旱相關的順式作用元件，所以可能被干旱脅迫所誘導[30]。LEA蛋白還有可能通過保護植物體內的酶活性來提高植物對干旱以及各種脅迫的耐逆性[31]。Wu等[32]發現在干旱和高鹽條件下轉LEA基因丹參體內丙二醛含量較低，并具有很高的超氧化物歧化酶活性和谷胱甘肽濃度。本研究中對MsLEA4-4基因進行了模擬干旱、高鹽、重金屬等逆境脅迫，發現干旱、高鹽、重金屬脅迫以及低溫脅迫均能誘導mRNA的積累，尤其是干旱脅迫下表現最為明顯，說明MsLEA4-4基因可能參與了這些逆境調控。因此下一步將對轉基因植株進行干旱、鹽等逆境脅迫，并研究轉基因植株體內抗氧化酶活性的變化情況，期望揭示紫花苜蓿MsLEA4-4基因在非生物逆境脅迫中的調控作用。

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CloningandexpressionanalysisofMsLEA4-4fromMedicagosativa

JIA Hui-Li1, WANG Xue-Min2, GUO Ji-Cheng3, GAO Hong-Wen2, WU Xin-Ming1, LIU Jian-Ning1, SHI Yong-Hong1, DONG Kuan-Hu4, WANG Yun-Qi1*

1.AnimalHusbandryandVeterinaryInstitute,ShanxiAcademyofAgriculturalSciences,Taiyuan030032,China; 2.InstituteofAnimalScience,ChineseAcademyofAgriculturesSciences,Beijing100193,China; 3.BeijingGreenJinghuaLandscapingCo.,Ltd,Beijing102209,China; 4.CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China

Late embryogenesis abundant (LEA) proteins are widely involved in many adverse situations for plants. In this study, we isolated a LEA4 gene from alfalfa by homology cloning strategy, termedMsLEA4-4. TheMsLEA4-4 encoding revealed 512 amino acids and structure analysis showed that the gene contains eleven repeating TAQAAKEKTQQ amino acids sequences. Quantitative real-time PCR was used to detectMsLEA4-4 expression quantities in adverse situations. Results revealed that the expression ofMsLEA4-4 was up-regulated by drought (PEG), salinity (NaCl), Cu2+, Zn2+and ABA stress. Gene expression was highest at 2 h and 8 h under the stress of NaCl, Cu2+and Zn2+. Under chilling and drought stress, the gene showed a rising trend. These results indicate that theMsLEA4-4 protein may be involved in the regulation of environment stress responses in alfalfa. The plant expression vector pCAMBIA3301-MsLEA4-4 was constructed and transgenic plants were obtained through infecting inflorescences ofArabidopsisbyAgrobacteriumtumefaciens-mediated transformation. The vector sequence was tested by antibiotic (PPT) and PCR in the genome of transgenic plants and indicated that the target gene had been transferred. This study provides basic information for further study of theMsLEA4-4 function in stress-tolerance regulation in alfalfa.

Medicagosativa; late embryogenesis abundant proteins (LEA); adversity stress; genetic transformation

10.11686/cyxb2017202http//cyxb.lzu.edu.cn

賈會麗, 王學敏, 郭繼承, 高洪文, 吳欣明, 劉建寧, 石永紅, 董寬虎, 王運琦. 紫花苜蓿MsLEA4-4基因的克隆、表達分析及遺傳轉化. 草業學報, 2017, 26(12): 108-116.

JIA Hui-Li, WANG Xue-Min, GUO Ji-Cheng, GAO Hong-Wen, WU Xin-Ming, LIU Jian-Ning, SHI Yong-Hong, DONG Kuan-Hu, WANG Yun-Qi. Cloning and expression analysis ofMsLEA4-4 fromMedicagosativa. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(12): 108-116.

2017-04-25；改回日期：2017-06-14

現代農業產業技術體系專項資金(CARS-35-25)，物種資源保護費(2130135)和山西省農業科學院畜牧獸醫研究所項目(xms201506)資助。

賈會麗(1980-)，女，山西臨猗人，助研，在讀博士。E-mail：jiahuili333@126.com*通信作者Corresponding author. E-mail: wangyunqi2017@126.com