磷添加條件下摩西球囊霉與禾草內生真菌對多年生黑麥草生長的影響

郭艷娥，王曉瑜，高萍，段廷玉

(草地農業生態系統國家重點實驗室，農業部草牧業創新重點實驗室，蘭州大學草地農業科技學院，甘肅 蘭州 730020)

磷添加條件下摩西球囊霉與禾草內生真菌對多年生黑麥草生長的影響

郭艷娥，王曉瑜，高萍，段廷玉*

(草地農業生態系統國家重點實驗室，農業部草牧業創新重點實驗室，蘭州大學草地農業科技學院，甘肅 蘭州 730020)

本試驗探究了不添加磷(P0)和添加50 mg/kg(P50)條件下，叢枝菌根(arbuscular mycorrhizae, AM)真菌摩西球囊霉(Glomusmosseae)和禾草內生真菌對多年生黑麥草生長、養分吸收和磷酸酶活性的影響。多年生黑麥草分別由含有禾草內生真菌(E+)和不含禾草內生真菌(E-)種子建植獲得。結果表明:1)AM真菌與禾草內生真菌可顯著影響多年生黑麥草的生物量(P<0.05)，二者共同作用(AME+)時生物量最低。P0處理，以AM真菌E-植株生物量最高。P50條件下，對照(NME-)最高；2)P添加平均提高AM真菌的侵染率11.40%，P0和P50條件下E+植株較E-植株的菌根侵染率分別低18.65%和11.77%；3)AM真菌未顯著影響P吸收(P<0.05)。禾草內生真菌增加了植株N含量，而AM真菌侵染降低了E+植株N含量；4)P添加顯著提高了磷酸酶活性(P<0.05)，不同處理以AME+的磷酸酶活性最高。兩種共生微生物在不同P條件下，單獨作用均有利于植物生長，共同作用時因對光合產物存在競爭，并未協同促進植物生長和養分吸收。

AM真菌；禾草內生真菌；磷添加；多年生黑麥草

多年生黑麥草(Loliumperenne)作為優良牧草和草坪草，具有養分利用率高，適口性好，再生能力強，建坪速度快，覆蓋能力以及抗病蟲害能力強等特性[1]，在世界各溫帶地區都有分布[2]。禾草內生真菌(Epichlo?)是指在禾草體內完成全部或大部分生活周期，而禾草不顯示明顯病害癥狀的一大類真菌[3]。禾草內生真菌對宿主生長的介導效應與P的有效性密切相關[4]。缺P時，接種內生真菌能促進宿主植物生長[5-6]。與非感染禾草內生真菌(E-)植株相比，內生真菌感染(E+)的高羊茅(Festucaelata)根系直徑減小，根毛長度增加，進而擴大了根系吸收面積[6]。此外，E+高羊茅還通過根部分泌酚類化合物對P脅迫作出反應[5]。目前，國際上銷售的多年生黑麥草種子多含有禾草內生真菌。

叢枝菌根(arbuscular mycorrhizae, AM)真菌廣泛存在于草地農業生態系統中，可與80%以上陸生植物根系建立共生關系，是土壤微生物的重要組成部分[7]。AM真菌促進植物生長的效應與菌根侵染改善植物的養分狀況(尤其是P)密切相關[8-10]，菌索及根外菌絲的生長，可比根系更遠地擴展到土壤中，從而增加宿主植物吸取養分的范圍[11-12]。AM真菌可與根際土壤和根皮層細胞形成密集的菌絲網，擴大植物根系吸收面積，縮短養分運輸距離[11]，分泌磷酸酶、有機酸和質子，改變根系周圍土壤理化性質，解離難溶性磷酸鹽[13]，并通過磷轉運蛋白完成磷從AM真菌到植物細胞的跨膜運輸[14]。由于AM真菌的宿主具有廣譜性，如單一宿主植物體內的菌絲在向周邊生長過程中遇到另一植物的根系，可再度侵染，在兩個植株間形成菌絲橋[15]，利用菌絲橋對磷進行傳遞是可行的，而且形成的菌絲橋越多，宿主植物獲得的養分越多[16]，這種作用在含P不足的土壤環境中更為顯著[17-19]。

我國土壤普遍缺P，改善P的吸收對促進植物生長和維持生態系統生產力具有重要意義[20]。在自然界和農業生態系統中，禾草能夠分別與內生真菌和AM真菌建立共生關系[21-22]，且有大量關于宿主植物與單一共生菌相互關系的報道。但二者共同作用對植物生長影響的報道還甚少，磷添加條件下兩種共生微生物互作對宿主影響的研究更是鮮有報道。前人多是基于內生真菌和AM真菌關系的研究，所得結論也并不一致[23-25]，當禾草內生真菌存在時，AM真菌是否還能促進養分吸收，尚不明確。本研究以多年生黑麥草為供試對象，旨在探究磷添加條件下AM真菌與禾草內生真菌對生長、養分吸收和磷酸酶活性的影響，以期為高效利用共生微生物，促進牧草生長提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1供試植物 多年生黑麥草種子AR1帶有內生真菌(E+)、Nil不帶內生真菌(E-)，由新西蘭國家草地研究所(AgResearch)、新西蘭皇家科學院院士John Caradus教授提供。

1.1.2AM真菌 摩西球囊霉(Glomusmosseae，G.m)購買于北京市農林科學院植物營養與資源研究所，“叢枝菌根真菌種質資源庫BGC”編號為NM04A，以三葉草擴繁所得的孢子、菌根根段、根外菌絲及培養基質作為接種物。

1.1.3供試土壤 土壤理化性質：pH 7.6；全P 19.62 mg/g；全N 18.35 mg/g。將過3 mm篩的土壤，于121 ℃下高壓蒸汽滅菌2 h，以消除基質中其他微生物的干擾，風干備用。

1.2 試驗方法

1.2.1試驗設計 盆栽試驗于2016年4-6月在蘭州大學草地農業科技學院智能溫室中進行，共設2個P水平，不添加P(P0)和添加50 mg/kg(P50)。試驗將20 g AM真菌接種物/盆平鋪在800 g滅菌的土壤上面，然后再覆蓋200 g土，對照(NM)則加等量滅菌接種物和接種物濾液，以保證微生物區系一致。挑選大小一致且籽粒飽滿的種子，用10% H2O2對其表面消毒10 min，然后用無菌水沖洗干凈，于25 ℃恒溫培養箱催芽。48 h后，選取長勢基本一致，大小相近的帶菌(E+)和不帶菌(E-)黑麥草植株分別移栽至直徑18 cm、高19 cm的花盆中，每盆移栽5株，出苗1周后，定苗至3株。定苗后，加入所需量的0.1 mol/L KH2PO4溶液，建立P添加處理，P0則加入等量蒸餾水，共設8個處理，每個處理8個重復。生長8周后收獲并測定植物生長及生理生化指標。

1.2.2指標測定 生物量采用烘干法測定；AM真菌侵染率的測定采用染色鏡檢法[26]；土壤速效P含量采用鉬銻抗比色法測定[27]；全N、全P含量：用球磨儀研磨植物干樣，并過2 mm篩，稱取0.25 g左右研磨好的植物樣，加入3.3 g催化劑(K2SO4和CuSO4研磨后10∶1混合)和10 mL濃H2SO4，420 ℃消煮2 h，冷卻后定容至100 mL，采用流動注射儀(FIAstar 5000 Analyzer, FOSS, Sweden)測定；葉片與根系磷酸酶活性的測定參照Sadasivam等的方法[28]；用改進的方法測定土壤磷酸酶活性[29]。

1.3 數據統計與分析

采用JMP IN 4對各指標進行交互效應以及方差分析，結果用GraphPad Prism 5.01作圖。

2 結果與分析

2.1 生物量

P添加對地上生物量無顯著影響(P>0.05)(表1)。低P條件下，以接種AM真菌的E-植株(AME-)生物量最高，其較NME-、NME+和AME+分別提高13.51%、19.09% 和32.41%。P50條件下，以不含兩種共生微生物處理(NME-)的黑麥草地上生物量最高，但其與AME-和NME+間的差異不顯著(P>0.05)(表1，圖1)。由此可知，P與AM真菌互作時存在交互效應，P添加降低了AM真菌對宿主地上部分生長的貢獻。此外，AM真菌與禾草內生真菌分別對宿主地上、地下生物量產生顯著或極顯著影響，二者共同作用(AME+)的地上、地下生物量皆為最低，AM真菌侵染抑制了E+植株的地上生長(P<0.05)(表1，圖1)。

表1 AM真菌、禾草內生真菌與P添加對多年生黑麥草各指標的方差分析(P值)Table 1 Variance analyses of E- and E+perennial ryegrass inoculated with or without AM fungi under phosphorus addition (P value)

ns:P>0.05. ACP: Acid phosphatase; ALP: Alkaline phosphatase.

圖1 AM真菌、禾草內生真菌與P添加對生物量的影響Fig.1 Biomass of E- and E+ perennial ryegrass inoculated with or without AM fungi under phosphorus addition 不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。下同。Different lowercase letters on the bars show significant differences among treatments (P<0.05). The same below.

P添加促進了植物根系生長，同時增加了AM真菌對宿主地下部分生長的貢獻(P<0.05)(表1，圖1)。AM真菌、P以及禾草內生真菌三者存在交互效應，P50條件下AME+的地下生物量比NME-、NME+和AME-分別低27.70%、18.69%和18.69%，低P條件AM真菌與禾草內生真菌各處理間的差異均不顯著(P>0.05)(表1，圖1)。

2.2 AM真菌侵染率

未接種AM真菌的植株均未發現菌根結構。AM真菌分別與P和禾草內生真菌存在交互作用，P添加顯著提高了AM真菌的侵染率，禾草內生真菌抑制了AM真菌的侵染(P<0.05)(表1，圖2)。接種AM真菌的E-、E+植株菌根侵染率差異顯著。P0和P50條件下，E+植株的侵染率比E-植株低18.65%和11.77%(P<0.05)(圖2)。

圖2 AM真菌、禾草內生真菌與P添加對侵染率和速效P含量的影響Fig.2 AM colonization and available P content of E- and E+ perennial ryegrass inoculated with or without AM fungi under phosphorus addition

2.3 植物P、N含量

P添加對黑麥草速效P、地上全P以及根系全P含量皆產生極顯著影響(P<0.05)(表1)。AM真菌與禾草內生真菌均對速效P含量無顯著影響，但二者共同作用以及與P三者共同作用時存在交互效應。P0條件下，AM真菌降低了E+植株的速效P含量。P50條件下，AME+處理的速效P含量最高(P<0.05)(表1，圖2)。

AM真菌對植物地上全P含量無顯著影響(P<0.05)(表1)。禾草內生真菌對地上全P含量具有極顯著影響，且與P存在交互效應，P添加顯著增加了E+植株的地上全P含量，NMP50較NMP0高40.45%，AMP50較AMP0高55.29%(P<0.05)(表1，圖3)。

與地上全P含量不同，AM真菌對根系全P含量產生極顯著影響(P<0.05)(表1)。接種AM真菌增加了根系全P含量，且其與P有交互作用，P添加顯著增加了AM所侵染宿主的根系全P含量(P<0.05)(表1，圖3)。感染禾草內生真菌E+植株的根系全P含量顯著高于E-植株(P<0.05)(圖3)。與地上全P含量類似，P添加同樣增加了E+植株的根系全P含量(圖3)。

P對地上全N含量無顯著影響，對根系全N含量產生極顯著影響(P<0.05)(表1)。P添加降低了AM侵染植株的全N含量，二者互作時存在交互效應(表1，圖4)。AM真菌對E+植株的地上、根系全N含量皆有顯著影響，P0條件AM真菌顯著降低E+植株的全N含量(P<0.05)(表1，圖4)。P50條件AM真菌侵染卻不同程度增加了E+植株的全N含量，其分別比NME-、NME+和AME-處理的地上全N含量高19.81%、19.65%和25.14%，AME+的根系全N含量亦為最高，但與NME+間的差異不顯著(P<0.05)(表1，圖4)。禾草內生真菌對地上、根系全N含量均產生顯著影響，P0條件NME+處理的全N含量最高，分別較NME-、AME-和AME+的地上全N含量高8.57%、12.66% 和10.00%，較根系全N含量高18.64%、30.05% 和44.77%(P<0.05)(表1，圖4)。

圖3 AM真菌、禾草內生真菌與P添加對全P含量的影響Fig.3 Content of total P of E- and E+ perennial ryegrass inoculated with or without AM fungi under phosphorus addition

圖4 AM真菌、禾草內生真菌與P添加對全N含量的影響Fig.4 Content of total N of E- and E+ perennial ryegrass inoculated with or without AM fungi under phosphorus addition

2.4 磷酸酶活性

P添加對葉片、根系以及土壤酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性皆產生顯著或極顯著影響(P<0.05)(表1)。P50的葉片、根系ACP和ALP活性均不同程度高于P0處理，土壤磷酸酶活性反之(圖5)。AM侵染與P存在交互效應，P添加條件下，AM侵染植株的葉片ALP、土壤ACP活性均不同程度高于低P處理，根系ACP、土壤ALP活性低于低P處理(表1，圖5)。禾草內生真菌對磷酸酶活性也有顯著或極顯著影響(P<0.05)(表1)。P添加對E+植株磷酸酶活性的影響不一致，P50條件下葉片ALP、根系ACP以及土壤ACP活性低于P0。P添加卻增加了E+植株葉片ACP、根系及土壤ALP活性(圖5)。AM真菌與禾草內生真菌互作時有交互效應，大多以二者共同作用的磷酸酶活性最高。不同P條件下二者的互作結果存在差異，根系ACP活性，P50條件下表現為最高；土壤ACP和ALP活性，低P條件AME+處理的最高，但與其他各處理間的差異均不顯著(表1，圖5)。

圖5 AM真菌、禾草內生真菌與P添加對磷酸酶活性的影響Fig.5 Phosphatase activities of E- and E+ perennial ryegrass inoculated with or without AM fungi under phosphorus addition

3 討論與結論

AM真菌可促進宿主植物生長，增加其對營養元素，尤其是P的吸收，這種作用在供P不足土壤環境中尤為顯著[17-19]。禾草內生真菌通過增加分蘗數、生物量以及提高宿主植物抗逆性對植物的生長起一定介導作用[30-32]，該效應亦與P的有效性密切相關[4]，缺P土壤中，感染內生真菌的E+植株比E-植株吸收更多的N、P等元素[33]。本研究接種AM真菌與禾草內生真菌均對多年生黑麥草的生物量產生顯著影響。P0條件下，接種AM真菌的地上生物量高于禾草內生真菌，這是由于AM真菌存在于宿主植物的根部，其根外菌絲可以直接吸收土壤中的N和P[17,34]，而禾草內生真菌通常位于宿主植物的地上部分，其通過改變根部形態和生理性狀等途徑來間接獲取養分[35]。因此，在該養分條件下AM真菌對多年生黑麥草生物量的貢獻較禾草內生真菌更大。P50水平下，地上和地下生物量均以NME-處理最高，AME+最低，接菌處理并未顯著提高宿主生物量，這與馮海艷等[36]的研究結果一致。在土壤有效養分供應充足的情況下，宿主植物與AM真菌之間的關系可能由互利共生轉變為偏利共生，即AM真菌從宿主植物獲取光合產物，但其幫助宿主植物吸收的養分對于植物的生長并未產生積極影響，甚至會導致宿主植物的生物量降低[37]。

P0條件下，不同處理對土壤速效P含量無顯著影響，這可能與土壤基質的養分供應狀況密切相關，當其滿足宿主植物生長所需時，接種AM真菌與禾草內生真菌對養分的介導效應勢必會減弱。P50條件下，AME-處理的速效P含量最低，AME+處理最高。菌根化植物對土壤中P元素的攝取包括直接吸收途徑(direct uptaking process, DUP)和菌根吸收途徑(mycorrhizal uptaking process, MUP)兩條，且MUP途徑對P吸收的貢獻更大[17]，非菌根植物只有DPU途徑，因此菌根化植物能夠吸收更多的P，相應土壤中殘留的速效P含量最低。由于禾草內生真菌對AM真菌的抑制作用，被宿主吸收利用的養分降低，土壤速效P的含量達到最高。此外P50水平下AME+處理的P含量最高，這與對N含量影響的結果保持一致。

不同P添加條件下的全N含量都以E+植株(NME+處理)比接種AM真菌(AME-)效果顯著。這是因為原始土壤P含量較高抑制了AM真菌的生長和代謝活性，致使AM真菌吸P量減少，造成菌根效應降低，同時減弱了AM真菌吸收 N 的能力[36]。P0條件NME+處理的全N含量最高，這與Malinowski等[33]的結果相似，表明存在于禾草莖葉中的內生真菌可以加強礦質元素的吸收。P50條件AME+處理最高，表明N、P積累存在協同效應，這與葉少萍等[38]在對不同P水平下AMF對狗牙根(Cynodondactylon)生長與再生影響的研究結果一致。

Ezawa等[39]用細胞化學的方法證明AM真菌菌絲釋放的ACP和ALP對菌絲體內多聚磷酸鹽的降解和運輸起著重要作用。Chang等[40]的研究進一步證實菌根化植物的磷酸酶活性高于非菌根植物。本試驗中AME-處理的磷酸酶活性最低，與前人的研究結果[41-44]并不一致。此外，供P條件對磷酸酶活性也產生顯著影響，同一P添加條件下AME+處理的磷酸酶活性最高，NME+次之，這與養分的結果基本一致，原因可能是養分對磷酸酶活性進行直接調節，AM真菌等通過改善養分狀況對其產生間接作用。

土壤pH是影響AM真菌孢子萌芽和菌絲生長的一個重要因子[45]。通常，AM真菌適應于中性和微酸性土壤環境[46]。本試驗所添加的0.1 mol/L KH2PO4溶液pH為4.5左右，供試基質pH 7.6，KH2PO4溶液對該基質具有一定的緩沖性。不同供P條件所造成的pH差異對AM真菌侵染率亦產生顯著影響，P50高于P0，這與AM真菌的適應性結果相一致。P添加處理的地上、地下生物量以及速效P、地上、根系全P含量皆高于P0，其原因可能是較低pH對植物的直接調節作用，抑或是通過影響AM真菌活性來間接改善宿主生存環境，促進對養分的吸收，并增加其生物量。此外，較低pH的地上與根系ACP和ALP活性高于P0，這與Joner等[47]的結果一致，酸性條件下的磷酸酶活性大于堿性條件。

AM真菌與禾草內生真菌共同作用對植物生長影響的報道尚不多見，所得結論也并不一致。例如感染內生真菌的高羊茅[48]、多年生[49]和一年生黑麥草(Lolium)[50]根系的菌根侵染率降低，禾草內生真菌的存在不同程度抑制了AM真菌的侵染，同樣AM真菌降低了禾草內生真菌的菌絲密度和寄主植物葉片中的生物堿含量，二者相互競爭，互相制約[21,49-50]。然而，Novas等[51]對天然禾草雀麥(Bromussetifolius)的研究發現，禾草內生真菌可以增加AM真菌的侵染率，而且在一定濃度內，禾草內生真菌浸提液作用下可以增加AM真菌的菌絲長度。Larimer等[52]對披堿草(Elymushystrix)的研究發現，內生真菌對AM真菌侵染率的影響因AM真菌種類的不同而不同，接種近明球囊霉(Glomusclaroideum)的E-植株的侵染率高于E+。相反，接種摩西球囊霉的E+植株的侵染率顯著高于E-。Vignale等[53]和Zhou等[24]的報道進一步指出，AM真菌與禾草內生真菌的互作可能與供試基質的養分狀況、內生真菌菌株類型以及AM真菌類型等諸因素相關。

本研究不同P條件下，接種AM真菌與禾草內生真菌都對菌根侵染率產生顯著影響。低P條件，AME+的侵染率比AME-降低18.65%，P50水平下降低11.77%，禾草內生真菌抑制了AM真菌的侵染。此外，P50的侵染率顯著高于P0。有關禾草內生真菌抑制AM真菌侵染的作用機制尚不明確，目前認為有如下3種可能：1)宿主植物在資源分配上存在權衡[21]，AM真菌和禾草內生真菌均須從宿主植物獲得光合產物[54-55]，但禾草內生真菌存在于地上部分，具有空間優勢，可能優先獲得光合產物，因而留給AM真菌的光合產物減少，從而抑制AM真菌的侵染[21]；2)禾草內生真菌增加植物對P的吸收和貯存[32]，改變宿主對營養元素的需求，降低AM真菌的有益作用[56]，從而間接影響AM真菌對植物的侵染；3)禾草內生真菌產生的化感物質抑制了AM真菌侵染[48]。接種AM真菌與禾草內生真菌(AME+)處理的生物量最低，這與侵染率的結果相關聯。

綜上所述，不同P條件下，AM真菌與禾草內生真菌單獨作用均促進了植物生長，共同作用時，因對光合產物存在競爭，禾草內生真菌抑制了AM真菌侵染，二者并未協同促進植物生長和養分吸收。

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EffectsofGlomusmosseaeandgrassendophytesonthegrowthofLoliumperenneunderphosphorusaddition

GUO Yan-E, WANG Xiao-Yu, GAO Ping, DUAN Ting-Yu*

StateKeyLaboratoryofGrasslandAgro-ecosystems,KeyLaboratoryofGrasslandLivestockIndustryInnovation,MinistryofAgriculture,CollegeofPastoralAgricultureScienceandTechnology,LanzhouUniversity,Lanzhou730020,China

This study aimed to determine the effects of arbuscular mycorrhizae fungiGlomusmosseaeand grass endophytes on the growth, nutrient absorption and phosphatase activities ofLoliumperennewithout phosphorus addition (P0) and with 50 mg/kg phosphorus addition (P50). Seeds of perennial ryegrass infected with grass endophyte (E+) and without grass endophyte (E-) were used to establish plants with and without the endophytes. The results showed that: 1) AM fungi and grass endophytes had significant effects on the host biomass (P<0.05); plants infected by both AM fungi and grass endophytes (AME+) had the lowest biomass. Plants infected by onlyGlomusmosseaehad the highest biomass under P0, while plants free of the two symbiosis fungi reached their highest biomass under P50. 2) Phosphorus addition increased mycorrhizal colonization of perennial ryegrass by 11.40%, while infection with grass endophytes inhibited plant mycorrhizal colonization by 18.65% and 11.77% under P0and P50respectively. 3)G.mosseaehad no significant effect on the absorption of P (P<0.05). Grass endophytes increased the content of total N, while AM colonization decreased the total N of plants with grass endophytes. 4) Phosphorus addition significantly increased phosphatase activities (P<0.05). Plants infected by AM fungi and grass endophytes had the highest phosphatase activities across the treatments. Each of the two symbiosis fungi improved plant growth when taken alone; however, they showed competition on photosynthate and did not enhance plant growth and nutrition absorption when applied together.

arbuscular mycorrhizal fungi; grass endophyte; phosphorus addition;Loliumperenne

10.11686/cyxb2017071http//cyxb.lzu.edu.cn

郭艷娥, 王曉瑜, 高萍, 段廷玉. 磷添加條件下摩西球囊霉與禾草內生真菌對多年生黑麥草生長的影響. 草業學報, 2017, 26(12): 160-169.

GUO Yan-E, WANG Xiao-Yu, GAO Ping, DUAN Ting-Yu. Effects ofGlomusmosseaeand grass endophytes on the growth ofLoliumperenneunder phosphorus addition. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(12): 160-169.

2017-03-01；改回日期：2017-04-17

國家綠肥產業技術體系(CARS-22)，中央高校基本科研業務費(2022016zr0003)和教育部創新團隊發展計劃項目(IRT_17R50)資助。

郭艷娥(1991-)，女，甘肅會寧人，在讀碩士。E-mail：guoye15@lzu.edu.cn*通信作者Corresponding author. E-mail：duanty@lzu.edu.cn