薄層色譜法和高效液相色譜法在白藜蘆醇膠囊定性定量研究中的應用

賈文斌，錢 躚，呂 磊

·基礎醫學·

·論著·

薄層色譜法和高效液相色譜法在白藜蘆醇膠囊定性定量研究中的應用

賈文斌，錢 躚，呂 磊

目的建立保健食品白藜蘆醇膠囊的定性定量檢測方法，為完善其質量標準提供科學依據。方法對白藜蘆醇膠囊中的主要成分白藜蘆醇采用薄層色譜法(TLC)進行定性鑒別，采用高效液相色譜法(HPLC)進行定量分析，實驗采用Hedara ODS柱；以甲醇∶水= 40∶60為流動相；柱溫：30 ℃；流速：1 ml/min；用紫外檢測器于306 nm處檢測。結果TLC鑒別中白藜蘆醇的斑點清晰；白藜蘆醇濃度在5.02～100.40 μg/ml時，濃度和峰面積呈良好的線性關系(r=0.999 9)；加樣回收率為99.38%～102.70%；最低檢出濃度為50 μg/ml。方法的精密度良好，RSD為0.59%(n=6)。結論該研究所建立的定性定量檢測方法快速、簡便、準確、靈敏度高，適用于白藜蘆醇的定性定量研究，可實現對白藜蘆醇膠囊的質量控制。

薄層色譜法；高效液相色譜法；白藜蘆醇膠囊；定性定量研究

白藜蘆醇(resveratrol,3,4′,5-三羥基二苯乙烯)是一種含有芪類結構的多酚化合物，廣泛存在于葡萄、虎杖、花生等天然植物或果實當中[1]。到目前為止，至少已在21科、31屬的72種植物中發現了白藜蘆醇。研究表明，白藜蘆醇能夠阻止低密度脂蛋白的氧化,具有潛在的防治心血管疾病、防癌、抗病毒及免疫調節作用,其作用主要是由于它的抗氧化特性，能抑制血小板聚集，減少心臟病的發生和控制其發展;還有抗菌、抗衰老作用[2-4]。近年來,美國天然藥物研究所(CNN)研究發現，白藜蘆醇具有抗艾滋病的作用[5]。由于這些作用比較明顯，白藜蘆醇已被喻為繼紫杉醇之后又一新的綠色抗癌藥。人們對其關注和研究越來越廣，現已將白藜蘆醇植物提取物作為食品添加劑使用或者制成具有降脂、美容、減肥和抗癌作用的天然保健食品及膠囊。但目前對白藜蘆醇的測定還沒有統一的標準，提取方法也各式各樣，目前白藜蘆醇的定量測定最常見的方法有：一階導數光譜法、高效液相色譜法(HPLC)、薄層掃描法、紫外分光光度法、氣相色譜/質譜法、毛細管電泳法、電化學發光法等[6]。本文建立了HPLC法測定膠囊中白藜蘆醇含量的方法，可用于白藜蘆醇膠囊的質量控制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器 Shimadzu LC-2010 C液相色譜儀；KQ-250DE型超聲儀(昆山市超聲儀有限公司)；BS 21 S萬分之一分析天平(德國Satorius公司)；PL5242純化水制備系統(美國PALL公司)；1621-1型高速離心機(上海醫療器械有限公司手術器械廠)；薄層硅膠GF254板。

1.2 試藥 白藜蘆醇(批號：111535-201703)由中國食品藥品檢定研究院提供，純度>98%。甲醇和乙腈均為色譜純(購自美國Merck公司)，氯仿、丙酮為色譜純(購自SIGMA公司)，水為超純水。白藜蘆醇膠囊供試品，規格：0.3 g/粒，90粒/瓶，批號：20161002，20161221，20170111，市售。

1.3 對照品與供試品溶液的制備 精密稱定白藜蘆醇對照品25.1 mg，置于50 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得0.502 mg/ml標準品溶液。取20粒膠囊，去殼取內容物，混合均勻后稱定20.0 mg，置于50 ml容量瓶中，加甲醇溶解，30 ℃超聲提取30 min，冷卻，加甲醇定容至刻度，搖勻，靜置后取2 ml于離心管中(12 000 r/min，離心半徑8 cm)離心10 min，取上清液以0.45 μm微孔濾膜濾過，得供試品溶液。

1.4 薄層色譜法(TLC)鑒別 取供試品和對照品溶液各10 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿∶丙酮=2∶1為展開劑，展開，取出，晾干，于360 nm處觀察熒光。

1.5 色譜條件 色譜柱：Hedara ODS柱，4.6 mm×150 mm，流動相：甲醇∶水=40∶60，柱溫：30 ℃，流速：1.0 ml/min，紫外檢測波長：306 nm，進樣量：20 μl。

1.6 專屬性 分別取甲醇溶液和樣品溶液20 μl進樣分析，記錄色譜圖溶劑峰后主成分峰保留時間的3倍。(1)標準曲線：將對照品溶液進行逐級稀釋,配制成濃度分別為100.40、80.32、50.20、25.10、10.04、5.02 μg/ml，系列對照品溶液，每個濃度點平行進樣3次，以對照溶液濃度(X)為橫坐標，色譜峰面積值(Y)為縱坐標進行線性回歸。(2)定量限和檢測限。將供試品溶液多次稀釋直至測定主峰峰高為基線噪聲的10倍和3倍左右。

1.7 精密度 取低中高3個濃度(10.04、50.20、100.40 μg/ml對照品溶液)20 μl進樣，重復測定6次，記錄峰面積，考察日內精密度。

1.8 重復性 取同一批號的膠囊內容物，按供試品溶液制備過程測定，代入標準曲線計算含量，平行測定6次。

1.9 穩定性 將供試品溶液分別于0、2、4、6、8、10 h取20 μl注入高效液相色譜儀，記錄峰面積。

1.10 加樣回收率 取白藜蘆醇樣品約10.0 mg，精密稱定，置50 ml量瓶中，配制濃度為1.07 mg/ml白藜蘆醇標準品溶液，精密量取溶液0.6 ml、1.0 ml、1.4 ml加至樣品溶液中，按樣品溶液配制過程處理，配制成濃度水平為80%、100%、120%的的供試溶液各3份。測定含量，計算回收率。

1.11 樣品含量測定 取3個批號白藜蘆醇膠囊各20粒，去殼取內容物，混合均勻，稱定本品約20 mg，精密稱定，置50 ml量瓶中，按供試品溶液進行制備，進樣20 μl，記錄色譜峰面積。

2 結果

圖1 白藜蘆醇膠囊中白藜蘆醇薄層鑒別結果

2.1 TLC鑒別 360 nm處觀察熒光。如圖1所示，供試品色譜中，在與對照品色譜相應斑點位置處，顯相同顏色的斑點。

2.2 專屬性 白藜蘆醇保留時間為11.908 min，空白對照無干擾并且白藜蘆醇主峰能與各雜質得到較好的分離，色譜圖見圖2。(1)標準曲線：線性方程：y=6.352 4x+1.387，r=0.999 9，結果表明，白藜蘆醇在該濃度范圍內線性關系良好。(2)定量限和檢測限：結果顯示本方法的定量限和檢測限分別為50 ng/ml和18 ng/ml。

圖2 白藜蘆醇膠囊中白藜蘆醇專屬性結果

2.3 精密度 3個批號20161002、20161221、20170111的精密度分別為1.64%、2.10%、1.38%，表明該方法的精密度較高。

2.4 重復性 結果示樣品平均含量10.52%，3個批號基本一致，RSD為2.24%，重復性較好。

2.5 穩定性 結果表明RSD為2.36%，樣品溶液在10 h內穩定性良好。

2.6 加樣回收率 各樣品量回收率平均(100.58±1.84)%，結果見表1。

表1 白藜蘆醇膠囊中白藜蘆醇回收率試驗結果

2.7 樣品含量測定 3個批號白藜蘆醇膠囊HPLC法含量測定分別為10.06%、11.13%和10.59%。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 精密稱定白藜蘆醇對照品25.1 mg，置于50 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.502 mg/ml標準品溶液，經逐級稀釋得濃度為4 μg/ml 溶液，經紫外掃描，記錄光譜圖。結果表明：本品在306 nm處有最大吸收。

3.2 色譜條件的選擇 經過文獻查閱，流動相主要采用乙腈-水系統，由于樣品處理過程中采用的溶劑是甲醇溶液，且甲醇成本較低，毒性較小，故考慮采用甲醇-水系統代替乙腈-水系統作為流動相。由于白藜蘆醇的結構中含有3個羥基，故考慮采用甲醇-水-甲酸系統流動相以及甲醇-水-磷酸鹽系統作為流動相。實驗結果表明，峰形并未得到明顯的改善。通過以上摸索，確定流動相采用甲醇-水系統，不斷調整流動相比例至甲醇∶水=40∶60時，色譜峰保留時間合適，峰形良好。

3.3 樣品前處理方法的選擇 由于前期預實驗藥品含量測定重復性不高，經過對實驗過程的反復研究，發現超聲這一步驟中存在很多影響提取的因素：超聲溫度、超聲加入甲醇的體積、超聲時間、避光操作等。該膠囊為中藥類，故超聲溫度對內容物的提取存在較大影響，實驗操作中嚴格超聲儀水溫在30 ℃，以保證每批樣品處理的平行性。超聲過程加入甲醇溶液的體積對內容物提取也有較大影響，實驗操作中保持每份內容物準確加入25 ml甲醇。超聲時間是對提取過程影響最大的一個因素。初步文獻查閱，超聲時間為20 min。實驗過程中，稱取6份膠囊內容物，精密稱定后，加甲醇25 ml溶解，各取2份超聲20、30、40 min后，按2供試品溶液制備過程自“冷卻，加甲醇定容至刻度”開始配置供試品溶液，進樣，結果表明，超聲30 min比20 min對內容物提取有較大的提高，而40 min比30 min提高不明顯，故確定內容物提取超聲時間為30 min。

相關文獻表明，白藜蘆醇見光和熱較不穩定，故實驗操作過程中需特別注意避光，以保證實驗結果的準確性。

[1] Perrone D, Fuggetta M P, Ardito F, et al. Resveratrol (3,5,4′-trihydroxystilbene) and its properties in oral diseases[J]. Experimental and Therapeutic Medicine, 2017, 14(1): 3-9. DOI:10.3892/etm.2017.4472.

[2] Abed E, Delalandre A, Lajeunesse D. Beneficial effect of resveratrol on phenotypic features and activity of osteoarthritic osteoblasts[J]. Arthritis Res Ther, 2017, 19(1): 151. DOI:10.1186/s13075-017-1365-2.

[3] Giuliani C, Iezzi M, Ciolli L, et al. Resveratrol has anti-thyroid effects both in vitro and in vivo[J]. Food Chem Toxicol, 2017, 107(Pt A): 237-247. DOI:10.1016/j.fct.2017.06.044.

[4] Zhao P, Sui BD, Liu N, et al. Anti-aging pharmacology in cutaneous wound healing: effects of metformin, resveratrol, and rapamycin by local application[J]. Aging Cell, 2017, 16(5): 1083-1093. DOI:10.1111/acel.12635.

[5] Symington B, Mapanga R F, Norton G R, et al. Resveratrol Co-Treatment Attenuates the Effects of HIV Protease Inhibitors on Rat Body Weight and Enhances Cardiac Mitochondrial Respiration[J]. Plos one , 2017, 12(1): e0170344. DOI:10.1371/journal.pone.0170344.

[6] di Donna L, Taverna D, Indelicato S, et al. Rapid assay of resveratrol in red wine by paper spray tandem mass spectrometry and isotope dilution[J]. Food Chemistry, 2017, 229: 354-357. DOI:10.1016/j.foodchem.2017.02.098.

Application of thin-layer chromatography and high performance liquid chromatography in the qualitative and quantitative research of the resveratrol capsule

JiaWenbin,QianXian,LyuLei

(FirstNavalConvalescentHospitalofQingdao,Qingdao31002,China)

ObjectiveTo establish a qualitative and quantitative detection method for the quality control of the resveratrol capsule, so as to provide scientific evidence for the perfection of the quality standards of the product.MethodsThe main ingredient of the capsule was identified by thin-layer chromatography (TLC) and was quantitatively determined by using high performance liquid chromatography (HPLC). Chromatographic separation was achieved on Hedara ODS column, with the mixture of CH3OH∶H2O=40∶60 as mobile phase, column temperature at 30 ℃, flow rate at 1ml/min and UV detection at 306 nm.ResultsTLC quality identification indicated that there were clear spots in the thin layer plate. There was a good linear relationship within the concentration of 5.02-100.4 μg/ml (r=0.999 9). Sample recovery rate was 99.38%-102.70%, and the lowest detection concentration was 50 μg/ml. With high accuracy, relative standard deviation (RSD) was 0.59% (n=6).ConclusionThe method established by the research was rapid, simple, accurate and highly sensitive, which could be used for qualitative and quantitative research of the resveratrol capsule, and also for the achievement of quality control of the resveratrol capsule.

Thin-layer chromatography; High performance liquid chromatography；Resveratrol capsule；Qualitative and quantitative research

R917

A

10.3969/j.issn.1009-0754.2017.06.011

266071 山東 青島，海軍青島第一療養院(賈文斌)；第二軍醫大學附屬東方肝膽外科醫院(錢躚、呂磊)

呂磊，電子信箱：k_owen2002@126.com

2017-04-22)

(本文編輯：甘輝亮)