福壽螺組織細(xì)胞原代培養(yǎng)及染色體核型分析

李緒杰，張福周，鄒湘輝，楊東娟，查廣才

（韓山師范學(xué)院食品工程與與生物科技學(xué)院，廣東 潮州 521041）

福壽螺組織細(xì)胞原代培養(yǎng)及染色體核型分析

李緒杰，張福周，鄒湘輝，楊東娟，查廣才

（韓山師范學(xué)院食品工程與與生物科技學(xué)院，廣東 潮州 521041）

無菌分離取得福壽螺肌肉、外套膜、腎臟及腦組織，分別采用胰酶消化法和研磨法進(jìn)行組織細(xì)胞分離，選取DMEM、F12和改良1640培養(yǎng)基分別進(jìn)行細(xì)胞原代培養(yǎng)，光鏡下觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，MTT法測定細(xì)胞活性。細(xì)胞培養(yǎng)一定時間后進(jìn)行染色體制備及染色體核型分析。結(jié)果表明，福壽螺組織細(xì)胞在不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)下活力具有明顯差異，用含水解乳蛋白的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的福壽螺外套膜和斧足組織細(xì)胞活力較好；用M199培養(yǎng)基培養(yǎng)的福壽螺斧外套膜和腦組織細(xì)胞活力較好。核型分析結(jié)果表明福壽螺染色體為二倍體（2n = 28，NF = 56），核型為2B型，核型不對稱系數(shù)為66.4%。

福壽螺；原代培養(yǎng)；染色體；核型分析

福壽螺在世界范圍內(nèi)造成了嚴(yán)重的農(nóng)業(yè)與生態(tài)危害，已被世界自然保護聯(lián)盟列入全球100種惡性外來入侵物種之一［1］。國家環(huán)保總局也將福壽螺列入首批（16種）入侵我國的 “危害最大的外來物種”之一［2］。目前，在脊椎動物的細(xì)胞建系上已有數(shù)百個品種［3］，在無脊椎動物研究上，國內(nèi)外學(xué)者在貝類細(xì)胞培養(yǎng)方面進(jìn)行了探索，但迄今為止僅建立了淡水雙臍螺胚胎（Biomphalaria glabrata embryonic，BGE）細(xì)胞系［4-6］，水生無脊椎動物由于細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能以及營養(yǎng)需求等方面的特殊性，細(xì)胞培養(yǎng)多停留在原代培養(yǎng)和有限傳代水平上［7］。有關(guān)淡水螺類的細(xì)胞培養(yǎng)報道目前只有姜德勛等［8］采用改良M199培養(yǎng)基對福壽螺部分組織進(jìn)行培養(yǎng)。染色體是遺傳物質(zhì)的載體，是基因的攜帶者，其數(shù)目和形態(tài)特征的變化常常會導(dǎo)致生物形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理和生化等許多遺傳特性的改變。核型分析是對體細(xì)胞或配子的染色體特征進(jìn)行定性和定量表述的一種基本方法，主要包括染色體數(shù)目、染色體形態(tài)、染色體的“解剖學(xué)”特征和染色體的分子特征［9-12］。染色體核型代表一個物種或個體在染色體水平上的表型［13］。有關(guān)福壽螺染色體核型研究報道至今只有文獻(xiàn)［14］。

本研究采用不同培養(yǎng)基分別培養(yǎng)福壽螺組織細(xì)胞，進(jìn)行福壽螺組織細(xì)胞體外培養(yǎng)建系；在細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)上，改進(jìn)染色體制作實驗程序，縮短實驗周期，進(jìn)行染色體核型分析。本研究從細(xì)胞水平上了解福壽螺的遺傳機制及其在入侵地占據(jù)生態(tài)優(yōu)勢機制，對福壽螺的預(yù)防控制具有重要意義，同時從細(xì)胞水平上研究福壽螺是否可作為敏感的環(huán)境指示生物，為濕地生態(tài)環(huán)境安全監(jiān)測提供參考與借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試福壽螺（3.56 g±0.42 g）采集于潮州市下津村農(nóng)家池塘，試驗主要試劑包括75%乙醇，Hanks液，鏈霉素、青霉素，0.25%胰蛋白酶液，改良1640、M199及DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清，MTT，DMSO等。

試驗主要儀器設(shè)備有臺式冷凍離心機、二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀、超凈工作臺、組織研磨器、倒置顯微鏡等。

1.2 試驗方法

1.2.1 研磨法處理組織 （1）取材：將整只福壽螺浸泡在75%乙醇溶液中30～60 s，用無菌棉簽擦凈福壽螺螺體及組織表面黏液，切取所需組織，把組織塊置于無菌培養(yǎng)皿中，用Hanks液漂洗2～3次，去除污物，置于青霉素（1.0×105IU /L） 和鏈霉素（1.0×105IU /L）的無菌水中30～60 min，分別轉(zhuǎn)入一定量基礎(chǔ)培養(yǎng)基中漂洗3次。（2）研磨：按組織大小加入10倍體積的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用經(jīng)滅菌的組織研磨器把組織磨碎。（3）分離：研磨液通過孔徑0.074 mm不銹鋼篩濾掉殘余的組織塊。800 r/min離心消化液3 min，吸出上清，分別加入適量1號DMEM（無血清含5 g/L水解乳蛋白）、M199（15%胎牛血清）、改良1640（15%胎牛血清）及2號DMEM（15%胎牛血清）培養(yǎng)液。（4）計數(shù)：用血球計數(shù)板計數(shù)，如細(xì)胞懸液細(xì)胞密度過大，須分別補加培養(yǎng)液調(diào)整，然后分裝入培養(yǎng)瓶中。

1.2.2 胰酶消化法處理組織 （1）取材：與1.2.1取材方法相同。（2）剪切：用眼科剪把組織剪碎，加入組織塊體積30倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入培養(yǎng)皿中，蓋上皿蓋，使組織塊均勻分布于皿底。（3）消化：37℃恒溫消化，每隔5 min搖動1次。（4）分離：在消化過程中見消化液混濁時，用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察組織，若已分散成細(xì)胞團或單個細(xì)胞時終止消化，隨即通過孔徑0.074 mm不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化的組織塊。低速800 r/min離心消化液3 min，吸出上清，加入適量1號DMEM（無血清含5 g/L水解乳蛋白）、M199（15%胎牛血清）、改良1640（15%胎牛血清）及2號DMEM（15%胎牛血清）培養(yǎng)液。（5）計數(shù)：與1.2.1計數(shù)方法相同。

1.2.3 原代培養(yǎng) 將細(xì)胞置于5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞的形態(tài)，每2 d更換1次培養(yǎng)基。待細(xì)胞貼滿瓶壁70%～80%時進(jìn)行酶解消化，傳代培養(yǎng)或制成細(xì)胞懸液待用。

1.2.4 MTT法檢測細(xì)胞活力 將上述獲得的相同密度的細(xì)胞懸液直接接種于96孔板中，每孔接種100 μL。培養(yǎng)3 d。每孔加入5 g/L MTT 20 μL，27℃孵育4 h，輕輕吸棄上清培養(yǎng)液，每孔再加入DMSO 150 μL，充分震蕩使結(jié)晶完全溶解，30 min后以DMSO為空白調(diào)零，測定570 nm波長處各孔的光吸收值（OD570）。

1.2.5 染色體制備及觀察 細(xì)胞預(yù)處理：收集生長旺盛的細(xì)胞，吹打散，加入秋水仙素使終濃度達(dá)到1 μg/mL進(jìn)行預(yù)處理；經(jīng)預(yù)處理6～8 h后，以800 r/min離心7 min，去上清；低滲：加入 0.075 mol/L KCl溶液1 mL，輕輕吹打，細(xì)胞重懸后補加0.075 mol/L KCl溶液7 mL，室溫下低滲20 min；預(yù)固定：加入3～4滴Carnoy，800 r/min離心7 min，去上清；固定：沿管壁慢慢加入3 mL固定液，2 min后用吸管輕輕的吹打分散細(xì)胞，固定10 min后，800 r/min離心去上清；此步驟重復(fù)2次；去上清后剩0.2～0.5 mL固定液，用吸管吹打使其成為細(xì)胞懸液；滴片：吸取細(xì)胞懸液滴于冰冷的載玻片上（經(jīng)80%乙醇浸泡，0～4℃冷藏），吹散，酒精燈外焰過火5 s左右；染色觀察：風(fēng)機吹干，置于裝有Giemsa染液的染色缸內(nèi)，染色20 min，水洗后吹干，顯微鏡觀察并拍照。

1.2.6 染色體核型分析 測量：標(biāo)本先行拍照放大后目測照片上每條染色體長度，按長短順序初步編號，寫在每條染色體短臂的一端，同時確定主縊痕的位置，用游標(biāo)卡尺逐條測量短臂和長臂長度。根據(jù)測量的數(shù)據(jù)，計算染色體的相對長度、臂比及著絲粒指數(shù)。福壽螺染色體用相對長度表示，比絕對長度更具有可比性、更穩(wěn)定，按照Levan［15］的公式計算：相對長度=（每個染色體的長度/全部染色體長度）×100；臂比值=長臂長度/短臂長度；著絲粒指數(shù)=（短臂長度/該染色體長度）×100。染色體臂數(shù)的計算按Matthhey［16］的建議中部和亞中部著絲粒染色體的臂數(shù)記為2，亞端部和端部著絲粒染色體的臂數(shù)記為1。染色體排列：按染色體由長到短同源染色體重新編號，由左向右順序貼在紙上。著絲點排列在同一水平線上，短臂在上，長臂在下。繪制核型模式圖及核型分析表：核型模式圖用Excel繪制，長臂在下，短臂在上，橫坐標(biāo)為染色體序號，縱坐標(biāo)為染色體的相對長度。

2 結(jié)果與分析

2.1 原代培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)特征

在相同培養(yǎng)條件下，對研磨法、胰酶消化法處理的福壽螺組織細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，培養(yǎng)7 d后觀察細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果（圖1）表明，外套膜組織細(xì)胞呈橢圓形或多邊形；腦組織細(xì)胞多呈圓形，細(xì)胞體透亮。研磨法處理的外套膜組織相對于酶解法處理的細(xì)胞長勢較慢，細(xì)胞折光性較弱。酶解法處理的腦組織細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞能貼壁單層生長，分生能力相對強于研磨法處理的腦組織細(xì)胞。

圖1 福壽螺原代細(xì)胞形態(tài)

2.2 MTT法檢測不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞活力

采用酶解法培養(yǎng)福壽螺原代細(xì)胞，對各組織細(xì)胞分別加入不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d后轉(zhuǎn)移到96孔板中進(jìn)行MTT活力檢測，結(jié)果（圖2）顯示，用1號DMEM含水解乳蛋白培養(yǎng)基培養(yǎng)的福壽螺外套膜和斧足組織細(xì)胞活力較好；用M199培養(yǎng)基培養(yǎng)的福壽螺外套膜和腦組織細(xì)胞活力較好。

圖2 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞活力

2.3 福壽螺染色體及核型分析

選擇形態(tài)清晰、分散性良好的6個（雌雄各半）染色體圖像，放大后對數(shù)碼照片上的染色體分別進(jìn)行測量、計算每條染色體的相對長度、臂比指數(shù)、著絲粒指數(shù)，然后取平均值，結(jié)果（圖3）顯示，福壽螺的染色體2n=28，為二倍體，未見性染色體。福壽螺核型公式為：2n=18 sm+10 m，NF=56；依據(jù)相對長度和臂比指數(shù)數(shù)據(jù)，福壽螺染色體為中部或近中部著絲點染色體。福壽螺著絲粒指數(shù)變化范圍為25.0～46.1；臂比值范圍在1.2～3.0之間（表1）。根據(jù)Stebbins［17］的核型分類標(biāo)準(zhǔn)及Aarno［18］的核型不對稱系數(shù)計算方法，福壽螺的核型為2B型，核型不對稱系數(shù)為66.4%，對稱程度較高。

圖3 福壽螺染色體核型分析結(jié)果

3 討論

3.1 組織細(xì)胞原代培養(yǎng)

自1907年Harrison創(chuàng)立動物組織和細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法以來，脊椎動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟，全世界已建立的細(xì)胞系株至少有數(shù)千種［3］，水生無脊椎動物由于細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能以及營養(yǎng)需求等方面的特殊性，很少有相關(guān)細(xì)胞系建立的報道［7］。在原代細(xì)胞培養(yǎng)過程中，防止微生物污染難度較大，細(xì)菌、真菌及立克次氏體污染是最常見的污染，且培養(yǎng)的大部分細(xì)胞通常在體外存活時間較短［19］。隨著無脊椎動物中的模式動物、經(jīng)濟動物、生物礦化理論、細(xì)胞免疫學(xué)、病毒學(xué)等方面的研究不斷深入，越來越多種類的無脊椎動物的細(xì)胞培養(yǎng)將會成為必然［20］。

目前，關(guān)于淡水螺類組織細(xì)胞體外培養(yǎng)的研究較少。本研究進(jìn)行福壽螺細(xì)胞原代培養(yǎng)的研究，旨在探討建立福壽螺組織細(xì)胞體外長期培養(yǎng)方法，建立福壽螺組織細(xì)胞系，為有機體代謝研究、環(huán)境監(jiān)測等創(chuàng)造平臺。為確定合適的組織細(xì)胞分離處理方法，本研究在相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)7 d后觀察研磨法、胰酶消化法培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)。酶解法和研磨法處理福壽螺組織細(xì)胞都會對細(xì)胞造成一定損害，試驗結(jié)果表明，采用酶解法處理的組織細(xì)胞的生長狀態(tài)相對于研磨法來說較好。在組織細(xì)胞分離培養(yǎng)方法選擇上，姜德勛等［8］采用切取組織塊直接培養(yǎng)，對細(xì)胞的損傷度最小，但由于細(xì)胞從組織塊遷出速度慢，使得細(xì)胞培養(yǎng)周期加長。采用酶解法可以短時間內(nèi)獲取大量單個細(xì)胞，縮短原代細(xì)胞培養(yǎng)的周期。在選擇合適培養(yǎng)基培養(yǎng)不同組織細(xì)胞實驗中，我們發(fā)現(xiàn)用含水解乳蛋白的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的福壽螺外套膜和斧足組織細(xì)胞活力較好；用M199培養(yǎng)基培養(yǎng)的福壽螺斧外套膜和腦組織細(xì)胞活力較好。福壽螺機體組織因代謝情況不一樣，營養(yǎng)需求也表現(xiàn)不一，因此不同組織細(xì)胞在不同培養(yǎng)基中活力具有差異。

表1 福壽螺染色體核型分析數(shù)據(jù)

培養(yǎng)基中使用動物血清既有優(yōu)點也有風(fēng)險［21］。國外研究學(xué)者采用改良的無添加胎牛血清的L-15培養(yǎng)基及輔助緩沖液培養(yǎng)無脊椎動物鋸緣青蟹（Scylla serrata）肝胰腺細(xì)胞，成功證明了L-15培養(yǎng)基促進(jìn)無脊椎動物組織如肝胰腺的生長和細(xì)胞存活的效率［22］。本研究比較了在細(xì)胞原代培養(yǎng)過程中添加水解乳蛋白和血清的DMEM培養(yǎng)基的效果差異，在后續(xù)的其他軟體動物組織細(xì)胞建系實驗過程中可以嘗試使用改良的培養(yǎng)基而不添加血清的方法。

3.2 染色體核型分析及意義

核型分析能明確識別各個染色體的特征，有助于基因定位和定體的研究，是遺傳學(xué)的一項基本技術(shù)［23］。葉冰瑩等［14］研究的大瓶螺核型采用體內(nèi)腹腔注射HCG，但隨著個體的生長發(fā)育，細(xì)胞進(jìn)一步分化，處于分裂狀態(tài)的細(xì)胞不多，較難找到分裂相［19］。研究者通過細(xì)胞培養(yǎng)手段，可以在較短時間內(nèi)獲得大量中期分裂相，從而便于進(jìn)行染色體計數(shù)和觀察［24］。

根據(jù)染色體核型分析試驗數(shù)據(jù)分析可得，福壽螺的染色體2n=28，為二倍體，未見性染色體，與葉冰瑩等［14］的研究結(jié)果一致。福壽螺核型公式為：2n=18 sm+10 m，NF=56；染色體為中部或近中部著絲點染色體，核型為2B型，核型對稱程度較高。本試驗結(jié)果在染色體核型公式、著絲粒指數(shù)、臂比值上與前人的研究結(jié)果具有一定的差異性。這可能是由于福壽螺染色體核型發(fā)生了微弱的進(jìn)化，盡管軟體動物和大多數(shù)非哺乳類脊椎動物與大多數(shù)胎盤類哺乳動物相比，它們在形態(tài)和核型上的進(jìn)化速度要慢得多［25］。

本研究采用不同培養(yǎng)基培養(yǎng)福壽螺不同組織細(xì)胞以獲得原代培養(yǎng)細(xì)胞，通過MTT法測定各組織細(xì)胞的活力，確定了福壽螺組織細(xì)胞合適的培養(yǎng)基，可為螺類及其他軟體動物組織細(xì)胞體外建系提供參考。通過細(xì)胞原代培養(yǎng)，在較短時間內(nèi)獲得大量中期分裂相，從而便于進(jìn)行染色體計數(shù)和觀察，進(jìn)一步對福壽螺染色體核型進(jìn)行制備和分析。染色體核型分析研究將有利于推動福壽螺遺傳機制、入侵占地生態(tài)優(yōu)勢機制的研究，同時對福壽螺防治具有積極意義。

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Primary histocyte culture and chromosome karyotype analysis of Pomacea canaliculata

LI Xu-jie，ZHANG Fu-zhou，ZOU Xiang-hui，YANG Dong-juan，ZHA Guang-cai
（School of Food Engineering and Biotechnology，Hanshan Normal University，Chaozhou 521041，China）

Pomacea canaliculata’s muscle，mantle，kidney and brain tissues were aseptic separated by trypsin digestion and grinding method. Cells were primary cultured with DMEM，F(xiàn)12 and modified 1640 medium.The growing status was observed under light microscope. The cell viability was determined by MTT method. After a certain time，chromosome preparation and chromosome karyotype analysis were conducted. Results showed that there was significant difference in histocytes viability among different culture medium. The better viability of mantle and muscle histocytes was cultured with DMEM medium containing hydrolyzed milk protein. The better viability of mantle and brain histocytes was cultured with M199 medium. In karyotype analysis，results showed that P. canaliculata was diploid （2n = 28，NF = 56）. The nuclear type was 2B and the nuclear asymmetry coefficient was 66.4%

Pomacea canaliculata；primary culture；chromosome；karyotype analysis

S917.4

A

1004-874X（2017）08-0127-06

李緒杰，張福周，鄒湘輝，等. 福壽螺組織細(xì)胞原代培養(yǎng)及染色體核型分析［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44（8）：127-132.

2017-06-17

中國科學(xué)院環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)國家重點實驗室開放基金（KF2016-28）；廣東省大學(xué)生科技創(chuàng)新培育專項（pdjh2017b0330）；廣東省教育廳科技創(chuàng)新項目（2013KJCX 0126）；潮州市科技引導(dǎo)計劃項目（2014SF02）

李緒杰（1996-），男，在讀本科生，E-mail：854151550@qq.com

鄒湘輝（1976-），男，博士，教授，E-mail：zxh11043@126.com

（責(zé)任編輯 崔建勛）