檀香紫檀苗木炭疽病病原菌分離鑒定

張少平，徐呈祥，李超群，鄭福慶

（肇慶學院生命科學學院，廣東 肇慶 526061）

檀香紫檀苗木炭疽病病原菌分離鑒定

張少平，徐呈祥，李超群，鄭福慶

（肇慶學院生命科學學院，廣東 肇慶 526061）

在檀香紫檀引種繁育中，發現其溫室中的苗木冬春時節發生一種較嚴重的葉部病害，但病害名稱、病原菌種類未見報道。以感染該病害的18月齡苗木為試材，分離純化后獲得病原菌株，采用形態學與分子生物學相結合的方法對其進行鑒定。根據分離到的該菌株菌落形態特征、分生孢子形態特征及病原菌rDNA-ITS 序列測試分析結果，確定分離到的菌株為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）；致病性試驗結果表明，膠孢炭疽菌是導致檀香紫檀葉片該種病害的病原菌，但屬非典型炭疽病。討論了檀香紫檀苗木炭疽病的防控。

檀香紫檀；葉部病害；病原菌；分離鑒定；膠孢炭疽菌

珍貴用材樹種，特別是紅木樹種及其森林資源，已經成為國家重要戰略資源和國際木材市場的競爭焦點［1］。檀香紫檀（Pterocarpus santalinus）是蝶形花科紫檀屬樹種，別名小葉紫檀，自然分布于熱帶原始森林，木材以印度邁索爾地區和緬甸北部地區出產的最著名，是真正被稱為“紫檀木”的紅木木材，在紅木中最為珍稀，品質和售價遠高于“花梨木”［2］。檀香紫檀原產地不在中國，中國是引種栽培國，但50多年的引種實踐表明中國熱帶和南亞熱帶地區對該樹種的引種是成功的，表現優良［3］。在紫檀屬各樹種中檀香紫檀抗寒性相對最強，在緯度更高地區引種推廣潛力更大，但迄今該種紫檀僅在海南省儋州、尖峰嶺有少量成年大樹，苗木稀缺，繁育技術尚不成熟［4-5］。在實生繁殖中，我們發現溫室中培育的檀香紫檀苗木葉部常發生一種侵染性病害，嚴重抑制生長，可致整株落葉甚至死亡。該樹種葉部病害，露地栽培的檀香紫檀苗木也有發生，但危害程度輕微。目前，檀香紫檀繁育及栽培文獻稀少，未見有其病害及防控的研究，該病害的名稱、病原菌種類尚不清楚。為此，我們進行了本項研究。

1 材料與方法

檀香紫檀種子引種自海南熱帶植物園，播種繁育成18月齡苗木。病害主要發生在冬春時節，早期主要是在葉片先端出現水漬狀病斑，繼之中心部位失水干枯、呈同心輪紋狀擴大，后期葉片基部也發生病害，蔓延速度很快，發病重時導致整個葉片干枯、脫落，甚至整株枯死（圖1）。

圖1 檀香紫檀苗木葉片病害發病癥狀

病原菌分離純化及形態學鑒定：在具有明顯染病癥狀的病葉組織病健交界處剪取5mm×5mm病組織，表面消毒后置于PDA平板培養基上，28℃培養，培養3 d后，對菌落進行純化并單孢分離，選取代表性菌株移接置PDA平板上，28℃黑暗培養6 d后，記錄菌落形態學特征，并對病原菌分生孢子進行顯微形態觀測、拍照［6-7］。

病原菌致病性檢測：選取無機械損傷，無病蟲害、長勢強健、未離體葉片做致病力檢測材料，在無菌操作室環境中，用無菌水沖洗葉片3次，然后，將分離獲得的菌株孢子用微量注射器針刺接種到健康葉片上，以滅菌蒸餾水為對照。接種病原菌的檀香紫檀苗木，在無菌室中培養、觀察，自然光照。

病原菌DNA提取：按1.0 g樣品加入4 mL（65℃）2% CTAB提取液。加入等體積酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1）。轉移上清液，加入等體積氯仿/異戊醇，12 000 r/min 離心10 min（4℃，重復操作）。向上清中加入2倍體積無水乙醇（可加入1/10 體積 3 mol/L NaAc（pH5.2）），充分混勻，使 DNA 析出，12 000 r/min離心 20 m，棄上清后加入500 μL70℅乙醇，12 000 r/min離心5 min后再用500 μL70%乙醇洗滌，-20℃保存［8］。

病原菌rDNA-ITS序列PCR擴增：選擇真菌rDNA-ITS通用引物。ITS1：5′-TCC GTA GGT GAACCT GCG G-3′；ITS4 ：5′-TCC TCC GCT TATTGA TAT GC-3′。反應體系如下：ddH2O 16.5 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，ITS1和 ITS4各 1 μL，Taq 酶 1μL，模板DNA1.0 μL，總體積25 μL。PCR反應條件：94℃預熱 5 min，94℃ 30 s，51℃ 30 s，72℃ 50 s，重復30個循環，最后72℃延伸10 min。PCR產物測序由廣州華大基因有限公司完成［9］。

病原菌rDNA-ITS序列分析與系統發育樹構建：將DNA序列測序結果提交到NCBI網站進行BLAST數據分析，利用ClustalX和MEGA5.1軟件對所得序列及選取的參比菌株的rDNA-ITS 基因進行同源性分析、并構建系統發育樹［10］。

2 結果及分析

2.1 病原菌的致病性

將純化后的病原菌接種到健康、無機械損傷的檀香紫檀苗木葉片上，接種7 d內葉片表現出感病癥狀即與田間栽培植株的相同。接種后不同時間葉片病癥：接種1 d：接種病原菌處的傷口出現黃褐色斑點；接種3 d：接種口周圍黃褐色斑點數量增多；接種5 d：黃褐色斑點面積明顯增大，各個斑點逐漸連接成片；接種7 d：黃褐色色斑除接種部位外基本感染葉片整個邊緣部分；接種9 d：黃褐色色斑從葉片邊緣向葉片中央擴展，相鄰未接種葉片出現類似癥狀；接種12 d：距黃褐色色斑較遠的葉片，從葉緣開始產生與被接種葉片相似的黃褐色斑塊；接種15 d：被接種葉片整片變為黃褐色，被感染的未接種病原菌葉片類似癥狀加重。在接種15 d內，對照葉片的接種口及其周圍無任何顯著變化（圖2）。這些結果表明，純化得到的菌株與實際侵染的病菌一致，且病原菌致病性強、蔓延很快。用發病的病斑進行常規分離，再次獲得與原分離菌一致的病原菌，根據柯赫氏法則，證明接種菌即為檀香紫檀苗木葉片病害的病原菌。

圖2 檀香紫檀葉片接種分離出病原菌 （L1）后的癥狀

2.2 病原菌的形態

分離純化到的病原菌株，初生菌絲為白色，比較疏松，生長3～4 d后加粗；菌落呈圓形，邊緣較整齊，淺褐色或黑褐色；菌落背面邊緣灰白色，中間深灰色，菌絲疏水性極強。生長10～15 d，菌絲轉為鼠灰色，產生黑色顆粒，培養基背面呈黑褐色。分生孢子盤初期多為圓形、黑褐色，后期可由若干個小分生孢子盤聯合成大型分生孢子盤，有時也產生單個近球狀的大型分生孢子盤，無色有隔菌絲。分生孢子圓形或長橢圓形，單胞無色，在PDA培養基上，產孢量低（圖3）。根據這些形態特征判斷，致病病原菌可能屬于炭疽菌屬（Colletotrichum Corda）真菌。

圖3 分離純化后獲得的病原菌（L1）顯微形態

2.3 病原菌 rDNA-ITS序列同源性分析及進化樹構建

由圖4（左）的DNA凝膠電泳圖譜可見，條帶清晰，表明成功提取了病原菌的DNA組，獲得的DNA質量符合后續研究要求。以所得DNA為模板，進行rDNA-ITS PCR擴增的結果見圖4（右）。經測序，所得rDNA-ITS序列的長度為550 bp。將獲得的核酸序列提交到NCBI核酸數據庫進行BLAST在線分析和序列同源性比較，將菌株L1 rDNA-ITS序列與GenBank中已有的 DNA序列進行同源性比較，發現GenBank中的膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）ITS序列同源性均為100%，從GenBank 數據庫中下載炭疽菌模式菌株ITS序列作為參考序列，以C. hippeastri ICMP17920、C. boninensen ICMP10338為外群參考序列，利用MEGA5.1構建了不同種炭疽菌的系統發育樹［7-8］，聚類分析結果表明病原菌株rDNA-ITS的序列與膠孢炭疽菌模式菌株C. gloeosporioides ICMP18738，C. gloeosporioides ICMP17821位于系統發育樹的同一分支，自展支持率為95%（圖5），而與其他炭疽菌遺傳距離較遠。根據病原菌菌落和分生孢子的形態特征以及 ITS 序列同源性比較的結果，確定檀香紫檀葉部病害的病原菌為膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）。

圖4 病原菌（L1）基因組DNA電泳結果（左）及rDNA-ITS 序列PCR擴增結果（右）

3 討論

膠孢炭疽菌是重要病原菌，侵染危害多種樹木［11］。對炭疽菌的分類較為困難，其菌絲和菌落在不同種類培養基及環境條件下形態差異大［12-13］。形態學鑒定與分子生物學相結合在炭疽菌分類中具重要作用。基于rDNA基因編碼序列將真菌種群間的親緣關系從遺傳進化角度加以區分，較能反映真菌間的遺傳關系。本研究以病原菌形態特征和生物學特征以及寄主范圍，并結合rDNA-ITS序列進行分析和比對，對檀香紫檀一種嚴重的葉部病害的病原菌進行了分離、鑒定，證明其為炭疽菌屬膠孢炭疽菌，這在檀香紫檀上系首次報道，對其繁育和栽培有突出意義。但是，從苗圃地及接種后的病癥圖片看，該病害應屬非典型的炭疽病癥狀。由于膠孢炭疽菌是一個很大的類群，我們計劃對該分離物進行更多植物種類的致病性分析。

圖5 基于炭疽菌rDNA-ITS序列的病原菌株（L1）系統發育樹

環境條件，包括氣候因子和管理措施，與樹木炭疽病菌發生和危害密切相關［14］。我們對檀香紫檀葉片膠胞炭疽病菌生物學特性的試驗研究表明，其在溫度為26～30℃、相對濕度為90%～95%的環境中蔓延最迅速，表現規律同這種病害在室內外的差異一致，啟示其幼齡苗木在溫室或塑料大棚中越冬應首先注意調控環境條件以使育苗設施中有良好的光照和通氣狀況以及較低的相對濕度。目前，防治膠孢炭疽病菌主要用百菌清、多菌靈、代森錳鋅、甲基托布津，但易產生抗藥性［15］。我們對導致檀香紫檀葉片發生嚴重病害的膠孢炭疽菌適宜的化防農藥進行試驗，前述4種藥劑均具有良好防效，且越早防治效果越好，但0.225 g/L咪鮮胺錳鹽防效更好。

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Pathogen isolation and identification of a leaf disease of red sandalwood （Pterocarpus santalinus） seedlings

ZHANG Shao-ping，XU Cheng-xiang，LI Chao-qun，ZHENG Fu-qing
（College of Life Sciences，Zhaoqing University，Zhaoqing 526061，China）

In the introduction and propagation of red sandalwood （Pterocarpus santalinus），we found a serious leaf disease of its seedlings in winter and spring seasons，but the name of the disease and its pathogen species have not been reported. The pathogen isolated from infected leaves of 18-month-old seedlings was identified as Colletotrichum gloeosporioides by morphological characteristics of colony and conidium，and analysis results of rDNA- internal transcribed spacer sequence （ITS） of the strain. Pathogenicity test results further confirmed that C. gloeosporioides was the pathogen responsible for the infected leaves symptoms of red sandalwood，however，the disease belongs to an atypical anthracnose. Control of the leaf diseases of red sandalwood seedlings was discussed.

red sandalwood （Pterocarpus santalinus）；leaf disease；pathogen；isolation and identification；Colletotrichum gloeosporioides

S763.15

A

1004-874X（2017）08-0085-05

張少平，徐呈祥，李超群，等. 檀香紫檀苗木炭疽病病原菌分離鑒定［J］.廣東農業科學，2017，44（8）：85-89.

2017-06-01

國家自然科學基金（31270674）；肇慶學院創新強校重點研究平臺（CQ201607）

張少平（1976-），男，博士，講師，E-mail：zzsspp2001@163.com

徐呈祥（1963-），男，博士，教授，E-mail：xucx2013@163.com

（責任編輯 楊賢智）