美拉德反應時間對煙草花蕾發酵液揮發性香味成分的影響

劉紹華，白家峰，冉盼盼，馬擴彥，許春平

（1.廣西中煙工業有限責任公司技術中心，廣西 南寧 530001；2.鄭州輕工業學院食品與生物工程學院，河南 鄭州 450000；3.重慶中煙工業有限責任公司技術研發中心，重慶 400060）

美拉德反應時間對煙草花蕾發酵液揮發性香味成分的影響

劉紹華1，白家峰1，冉盼盼2，馬擴彥3，許春平2

（1.廣西中煙工業有限責任公司技術中心，廣西 南寧 530001；2.鄭州輕工業學院食品與生物工程學院，河南 鄭州 450000；3.重慶中煙工業有限責任公司技術研發中心，重慶 400060）

為研究不同美拉德反應時間對煙草花蕾發酵液揮發性香味成分的影響，煙草花蕾經高活性產香酵母發酵后，通過時間調控優化美拉德反應制備煙用香料，并對此香料進行主成分分析以及加香評吸。結果表明：經同時蒸餾萃取提取，美拉德反應8 h樣品香味物質有45種，反應12 h樣品香味物質有38種，反應16 h樣品香味物質有45種，反應20 h樣品香味物質有42種，主要包括醇、醛、酸、酯、酮、呋喃和吡啶等。煙草花蕾發酵液經不同美拉德反應時間處理后香味成分主成分分析可知，美拉德反應時間8、12、20 h樣品的香味成分有顯著差異，美拉德反應時間16、12 h樣品的香味成分無顯著差異。美拉德反應時間12 h的樣品對空白煙進行加香評吸的效果最佳。

產香酵母；美拉德反應；煙草花蕾；優化；主成分分析

美拉德反應是氨基化合物和還原糖之間發生的反應，是形成煙草特征香味的主要途徑之一。美拉德反應產物含有大量香味物質，大部分與煙香諧調，能有效改善低次煙草的品質，減少木質雜氣，增加煙香，為一類很好的煙用香料。張鵬等［1］基于美拉德反應原理，分析了煙末提取濃縮液美拉德反應時間對煙草薄片質量的改善效果，研究發現美拉德強化修飾可有效降低煙末提取液中的不利成分，增加風味致香成分，如糠醛、巨豆三烯酮等醛酮類物質；減少薄片雜氣和木質氣。王瑩［2］對美拉德反應體系的工藝，最佳美拉德反應產物的分離鑒定、對比分析及其卷煙加香應用，結果發現在烤煙型卷煙中添加適宜濃度的美拉德反應產物對感官質量有顯著的改善作用，可以增補煙香，改善吃味，減輕雜氣和刺激性，增強煙氣的細膩性、醇和性，使香氣更加豐滿、協調。程傳玲等［3］以山梨糖和脯氨酸為原料，模擬美拉德反應體系，結果顯示美拉德反應后的產物利用氣-質聯用儀對產物進行GC-MS分析，檢測到吡啶類等雜環化合物，這些物質是卷煙中的重要香氣成分。班強等［4］考察了廢煙末煙膏與脯氨酸的美拉德反應，結果表明對最佳美拉德反應產物進行GC/MS分析鑒定，35種產物中包括2-甲基吡嗪、2-乙酰基呋喃、2-吡咯烷酮等對煙草香味有著很好修飾作用的美拉德反應產物，以及煙堿、苯乙烯、香草醛、4，7，9-巨豆三烯-3-酮等加強煙草本香化合物，可以作為煙用香料用于卷煙加香。本試驗以打頂廢棄的煙草花蕾為原料，經一定條件的發酵處理得到發酵液，通過對發酵液進行不同美拉德反應時間處理，對美拉德反應產物進行加香評吸，同時蒸餾提取香味物質，GC-MS分析以及主成分分析香氣成分，旨在探究不同美拉德反應時間對煙草花蕾香料的影響以及美拉德反應產物對卷煙加香的效果，以期對新型煙草香料的制備提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料云煙87煙草花蕾，由廣西中煙工業有限責任公司提供；釀酒高活性酵母；試劑葡萄糖、谷氨酸、磷酸氫二鈉、磷二氫鈉、3，5-二硝基水楊酸鈉、丙二醇、1 moL/L NaoH、1 moL/L H2SO4、二氯甲烷、0.8211 moL/mL乙酸苯乙酯等。

儀器設備：Q-100A3 旗箭粉碎機（上海冰都電器有限公司），HS-4 恒溫水浴鍋（上海醫療器械五廠），PL203 電子分析天平（0.0001 g）梅特勒-托利多儀器（上海有限公司），RIGOL UItra-3400紫外分光光度計（河北惠采科技有限公司），DGX-9143 電熱恒溫鼓風干燥箱（上海福瑪設備有限公司），BIORIDGE盧湘儀TGL-16M離心機，同時蒸餾萃取裝置（鄭州科技玻璃儀器廠），6890 /5973 氣相色譜/質譜聯用儀（安捷倫科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 產香酵母活化 將產香酵母用35～40℃的水活化15～20 min，然后溫度降至34℃以下活化1～2 h。將10 g產香酵母放入250 mL錐形瓶中，加入100 mL 35～40℃無菌水在32℃水浴鍋中活化2 h，備用。

1.2.2 煙草花蕾滅菌處理 將干燥的云煙87煙草花蕾粉碎，過0.250 mm孔徑篩網，置于500 mL錐形瓶中以料液比為1∶10比例加入200 mL蒸餾水。水浴鍋中沸水浴30 min達到滅菌效果。

1.2.3 美拉德反應處理 向發酵后4個樣品中各加入20 mL丙二醇調pH7用封口放入70℃烘箱分別反應8、12、16、20 h。

1.2.4 同時蒸餾萃取提取香味物質 將美拉德反應產物倒入同時蒸餾萃取裝置一端的平底燒瓶中，加入100 mL蒸餾水，用電子調溫電熱套加熱，裝置的另一端蒸餾瓶中注入50 mL二氯甲烷，于60℃水浴中加熱。當水與二氯甲烷分層開始計時，萃取2.5 h，然后在二氯甲烷萃取液中加入含量為0.8211 mg/mL的乙酸苯乙酯1 mL和無水硫酸鈉若干，靜置過夜。然后于35～40℃濃縮，濃縮至約1 mL轉至樣品瓶中，低溫密封保存，用于GC/MS定量分析［5-7］。

1.2.5 GC-MS條件及分析 色譜條件：色譜柱為HP-5MS色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm），進樣口溫度：280℃，分流比10∶1，進樣量1 μL載氣：氦氣，載氣流量為：3 mL/min，升溫程序為：初起始溫度50℃，以4℃/min升至280℃；質譜條件：EI源，接口溫度270℃，電子能量：70 eV，四極桿溫度：150℃，采集模式 ：掃描［8］；質量掃描范圍 ：35～550 m/z。利用Nist11譜庫將質譜圖中各色譜峰進行檢索，同時進行人工解析，對化學成分進行定性分析（匹配度＞80）。采用內標法（內標物0.8211 mg/mL的乙酸苯乙酯）對物質進行定量。揮發性物質含量（μg/g）=（內標物質量×揮發性物質峰面積×1000）/（煙草花蕾質量×內標物峰面積）［9］

1.2.6 主成分分析 采用IBM SPSS Statistics21軟件對揮發性物質主成分進行分析［10-13］，根據相關系數列出相關矩陣，計算各主成分的系數及綜合得分，并進行排序。根據不同美拉德反應時間的煙草花蕾發酵液有關成分的含量標準化值與特征根、特征向量，計算各主成分值，并以此作散點圖。

1.2.7 感官評價 待加香評吸的煙來自廣西中煙公司的空白煙，每個試驗處理為不同美拉德反應時間處理煙草花蕾發酵液后的美拉德放應產物，經離心取2 mL上清，加香后在溫度22（±2）℃，相對濕度60（±5）%的恒溫恒濕箱中平衡24 h待評吸。取僅加水的空白煙作對照。請廣西中煙評吸小組進行感官評吸，評吸小組10人，參照《卷煙 第四部分：感官技術要求》（GB 5606.4—2005） 對卷煙樣品進行感官評價分析［14］。

2 結果與分析

2.1 煙草花蕾發酵液經不同美拉德反應時間處理后GC-MS數據分析結果

發酵后的樣品進行4個時間梯度的美拉德反應，經同時蒸餾萃取提取香味物質GC-MS分析結果見表1。

表1 美拉德反應香味物質含量

（續表1）

（續表1）

從表1可以看出，發酵后的煙草花蕾經不同美拉德反應時間處理，利用蒸餾萃取技術提取的揮發性成分共計79種。揮發性香味物質含量及種類差異很大，其中經過美拉德反應8 h樣品香味物質有45種，反應12 h樣品香味物質有38種，反應16 h樣品香味物質有45種，反應20 h樣品香味物質有42種，主要包括醇、醛、酸、酯、酮、萜稀類，以及呋喃、吡啶苯胺等。煙草花蕾在發酵后經不同美拉德反應時間處理后，含有各自特有的香味成分，美拉德反應8 h處理特有的香味物質有硬脂酸、辛酸、亞麻酸、順式-9-十八醛烯、1-十九烯、2-甲基-6-乙基苯胺5種；美拉德反應12 h處理特有的香味物質有金合歡醇、十二烷硫醇、甲基壬基甲酮、1-二十三稀、1-二十六碳稀、（-）-a-芹子稀、g-古蕓稀、十八烷基乙烯基醚8種；美拉德反應16 h處理特有的香味物質有反-2，6-壬二醛、乙酸蘇合香酯、硬脂酸甲酯、（E）-9-十八烯酸甲酯、（E，E）-1，3，5-十一三烯、反，反，順-1，3，5，8-十一碳四稀、（3E，5Z）-1，3，5-十一烷三烯、2，3，6-三甲基吡啶、2，3-聯苯吲哚9種；美拉德反應20 h處理特有的香味物質有對甲基苯甲醛、鄰甲基苯乙酮、4-癸烯、2-乙酰基吡咯4種。從表1還可以看出，香氣總量由高到低依次為美拉德反應8、12、20、16 h樣品，最高達787.75 μg/g。美拉德反應12 h樣品中的肉豆蔻酸、二氫獼猴桃內酯、大馬士酮、吲哚含量較美拉德反應8、16 h樣品中含量下降；棕櫚酸甲酯、巨豆三烯酮、三環烯、煙草烯、2-正戊基呋喃含量較美拉德反應8、16 h樣品中含量上升。

2.2 主成分分析

利用 IBM SPSS Statistics 21 軟件因子分析模塊中的降維分析，對發酵液不同美拉德反應時間處理后的79種揮發性成分進行主成分分析，得到主成分載荷矩陣（表2）、特征值和貢獻率（表3）。

表2 主成分載荷矩陣

（續表2）

表3 3種主成分的特征值和貢獻率

從表2可以看出，苯乙醛、肉豆蔻酸、正十五酸、苯乙醇、6，10，14-三甲基-2-十五烷酮、反式-5-甲基-3-（1-甲基乙烯基）-環己烯、棕櫚酸甲酯、氧化石竹烯、11-烯酸、軟脂酸、棕櫚油酸、大馬士酮、三環烯、1-十八烯、巨豆三烯酮、4-乙烯基-4-甲氧基苯酚、麥由酮、乙酸蘇合香酯、硬脂酸甲酯、（E，E）-1，3，5-十一三烯、（3E，5Z）-1，3，5-十一烷三烯、反，反，順-1，3，5，8-十一碳四稀、2，3，6-三甲基吡啶、2，3，5-三甲基吡啶、反-2，6-壬二醛、（E）-9-十八烯酸甲酯、2，3-聯苯吲哚、亞油酸、2-壬酮、甲基庚烯酮30種物質在主成分1中有較高矩陣，即主成分1反應上述30種指標的信息；鄰甲基苯甲醛、二氫獼猴桃內酯、1-二十七烷醇、間甲基苯乙酮、寸拜精、14-甲基-（Z）8-順-11-十六碳烯醛、辛酸、2-甲基-6-乙基苯胺、順式-9-十八醛烯、硬脂酸、1-十九烯、吲哚、亞麻酸、肉豆蔻醛、反式-13-十八烯酸、N-乙基-2-甲基苯胺、（1S，2E，4S，5R，7E，11E）-瑞士五針松-2，7，11-三亞乙基四胺-4，5-二醇、N-（2-三氟甲基苯）-3-吡啶甲酰胺肟、鄰苯二甲酸二丁酯19種物質在主成分2中有較高矩陣即主成分2反應上述19種指標的信息；（-）-a-芹子稀、金合歡醇、十二烷硫醇、甲基壬基甲酮、1-二十三稀、1-二十六碳稀、十八烷基乙烯基醚、g-古蕓稀、1，5，9-三甲基 -12-（1-甲基乙基）-4，8，13，-環十四烷三烯-1，3-二醇、2-正戊基呋喃、3-（4，8，12-三甲基十三烷基）呋喃11種物質在主成分3中有較高矩陣即主成分3反應上述11種指標的信息。

由表3可知，主成分1、2、3的累積貢獻率達到100.000%，因此，79種揮發性成分可以用主成分1、2、3進行主成分分析。

根據表1中4個不同美拉德反應時間處理樣品的79種香氣成分的相對含量、表3中前3個主成分的特征值和表2中79種香氣成分的載荷值計算出4個樣品中的第一、第二和第三主成分值，然后以第一主成分為Z坐標，第二主成分為X坐標，第三主成分為Y坐標，做散點圖（圖1）。由圖1可知，4個樣品根據距離遠近分為3個區域，其中美拉德反應時間處理8、20 h的樣品距離較遠，美拉德反應時間處理12、16 h的樣品距離較近。

圖1 美拉德反應時間處理樣品的主成分分散圖

圖2由79種香氣成分（與表2香氣成分相對應）的第一主成分為坐標、第二主成分為坐標、第三主成分為坐標作散點圖，見圖2。由圖2結合圖1、表2可知，影響美拉德反應時間8 h樣品的香氣組成的香氣成分主要集中在第一主成分的正半軸、第二主成分的正半軸、第三主成分的負半軸，按影響力大小依次為辛酸（49）、吲哚（54）、順式-9-十八醛烯（51）、2-甲基-6-乙基苯胺（50）、己二酸二辛酯（79）、寸拜精（47）；影響美拉德反應時間20 h樣品的香氣組成的香氣成分主要集中在第一主成分的正半軸、第二主成分的負半軸、第三主成分的負半軸，按影響力大小依次為反式-5-甲基-3-（1-甲基乙烯基）-環己烯（6）、棕櫚酸甲酯（7）、6，10，14-三甲基-2-十五烷酮（5）、反油酸（34）、己酸（35）、對甲基苯甲醛（33）。

圖2 79種揮發性成分的主成分散點圖

2.3 煙草花蕾發酵液經不同美拉德反應時間處理后的感官品質分析

煙草花蕾發酵液經不同美拉德反應時間處理后的感官評吸結果見表4。從表4可以看出，經過不同美拉德反應時間處理后的樣品與對照相比，光澤無變化，而香氣、諧調性、雜氣、刺激性和余味均有不同程度變化。采用美拉德反應8 h的樣品對空白煙進行加香，與對照相比，香氣質、協調性、刺激性和余味降低，雜氣提升；采用美拉德反應12 h的樣品對空白煙進行加香，與對照相比，雜氣和刺激性降低，香氣質、協調性和余味提升；采用美拉德反應16 h的樣品對空白煙進行加香，與對照相比，協調性、雜氣和刺激性降低，香氣質、和余味提升；采用美拉德反應20 h的樣品對空白煙進行加香，與對照相比，香氣質、協調性、雜氣和余味降低，刺激性提升。綜上美拉德反應12 h的樣品對空白煙進行加香評吸的效果最佳。

表4 不同美拉德反應時間處理后的感官評吸結果（分）

3 結論與討論

以廢棄煙草花蕾為原料，發酵后得到的煙草花蕾發酵液經不同美拉德反應時間處理后香味成分含量變化較大，美拉德反應8 h的樣品揮發性物質總含量達787.75 μg/g，美拉德反應16 h的樣品揮發性物質總含量達573.07 μg/g；香味物質種類變化不大，經過美拉德反應8 h樣品香味物質有45種，美拉德反應12 h樣品香味物質有38種，美拉德反應16 h樣品香味物質有45種，美拉德反應20 h樣品香味物質有42種；煙草花蕾發酵液經不同美拉德反應時間處理后香味成分主成分分析可知，美拉德反應時間8、12、20 h樣品的香味成分有顯著差異，美拉德反應時間12、16 h樣品的香味成分無顯著差異；從不同美拉德反應時間處理后的感官評吸總分來看，美拉德反應時間12 h的樣品對空白煙進行加香評吸的效果最佳。

關于美拉德反應的研究很多，但基于煙草花蕾發酵液美拉德反應的研究還沒有。大田中大量打頂的煙草花蕾被廢棄，煙草花蕾的再利用很大程度上擴大了煙草來源。利用廢棄的煙草花蕾制備煙用香料有很大的發展前景，煙草花蕾經發酵后含有更多的糖和氨基酸更有利于美拉德反應，可以改善煙草香氣。

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［14］ 中國國家標準化管理委員會. 卷煙 第四部分：感官技術要求GB5606. 4-2005［S］. 北京：中國標準出版社，2005．

Effects of Maillard reaction time on volatile aroma components in tobacco bud fermentation broth

LIU Shao-hua1，BAI Jia-feng1，RAN Pan-pan2，MA Kuo-yan3，XU Chun-ping2
（1.Technical Center of China Tobacco Guangxi Industrial Co.， Ltd，Nanning 530001，China ；2.College of Food and Biology Engineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450002，China；3.Technical Center of China Tobacco Chongqing Industrial Co.， Ltd，Chongqing 400060，China）

In order to investigate the effects of Maillard reaction time on the aroma of tobacco bud fermentation broth，the tobacco flavor was prepared and optimized by Maillard reaction time control after the tobacco bud was fermented by high-active aroma-producing yeast，and the flavor was analyzed by principal component analysis and sensory evaluation. The results showed that: by simultaneous distillation and extraction，the kind of aroma components in the flavor sample of 8 h Maillard reaction was 45，and the kind of aroma components in the flavor sample of 12 h Maillard reaction was 38，and the kind of aroma components in the flavor sample of 16 h Maillard reaction was 45，and the kind of aroma components in the flavor sample of 20 h Maillard reaction was 42，including alcohols，aldehydes，acids and esters，ketones，furans and pyridine etc. After the tobacco bud fermentation broth treated by Maillard reaction with different time，flavor components were analyzed by principal component analysis and it showed that there were significant differences among three samples of aroma components of Maillard reaction time of 8 h，12 h，and 20 h，and no significant difference among three samples of aroma components of Maillard reaction time between 16 h，and 12 h. By sensory evaluation，it showed that by flavoring into blank cigarette，the sample of aroma components of Maillard reaction time of 12 h was the best.

Saccharomyces cerevisiae；Maillard reaction ；tobacco bud ；optimization ；principal component analysis

TS49

A

1004-874X（2017）08-0096-10

劉紹華，白家峰，冉盼盼，等. 美拉德反應時間對煙草花蕾發酵液揮發性香味成分的影響［J］.廣東農業科學，2017，44（8）：96-105.

2017-06-04

廣西中煙合作項目（20141011）

劉紹華(1962- )，男，博士，研究員，E-mail：lshaohua18@163.com

許春平（1977-），男，博士，教授，E-mail：xuchunping05@163.com

（責任編輯 白雪娜）