蛋白鮮味肽調(diào)味品生產(chǎn)工藝初探

王 虹，劉 鑫，李佳妮，鄒曉霜，王 歡，齊寶坤，王中江，江連洲

(1黑龍江珍選食品有限公司，哈爾濱 150060；2東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030)

蛋白鮮味肽調(diào)味品生產(chǎn)工藝初探

王 虹1，劉 鑫1，李佳妮2，鄒曉霜2，王 歡2，齊寶坤2，王中江2，江連洲2

(1黑龍江珍選食品有限公司，哈爾濱 150060；2東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030)

蛋白二次酶解技術(shù)生產(chǎn)蛋白鮮味肽能夠在保有傳統(tǒng)鮮味的同時，有效提高蛋白質(zhì)得率，利于人體吸收。試驗根據(jù)不同水產(chǎn)品的呈味特點，選擇沙丁魚和對蝦為實驗原料，利用復(fù)合蛋白酶對原料進行初步定向酶解并超濾，制備具有獨特風味的短肽。采用響應(yīng)面法優(yōu)化酶解水產(chǎn)蛋白工藝，水解度作響應(yīng)值，以探究酶添加量、酶解溫度、時間及pH值對鮮味肽得率的影響，得到初步酶解制備鮮味肽最優(yōu)工藝條件：復(fù)合蛋白酶加酶量3.3%、溫度57℃、酶解時間3.5h、pH為7.1。

鮮味肽；酶解；超濾

現(xiàn)今國民的飲食趨勢正逐漸發(fā)生轉(zhuǎn)變，出于對口味及安全等角度考慮[1]，制備易于存放攜帶、天然健康而又風味多樣的復(fù)合調(diào)味料更易受到消費者親睞[2]。在國外調(diào)味料領(lǐng)域中，復(fù)合調(diào)味料占據(jù)了80%多的市場份額，而國內(nèi)復(fù)合調(diào)味品市場將同樣具有無限商機與巨大潛力[3]。

鮮味肽在保有其他味覺條件不被破壞的情況下，還可提升各自的呈味風味，所以鮮味肽在菜、乳、肉等食材增味方面具有突出效果[4]。對蝦及沙丁魚中均含豐富蛋白質(zhì)及營養(yǎng)物質(zhì)[4-5]，是用于制備蛋白鮮味肽的優(yōu)選食材。我國在呈味肽的理論及應(yīng)用探究領(lǐng)域存在一定局限，復(fù)合調(diào)料也存在食用品質(zhì)差、風味失真等缺陷[6]。迄今，采用酶技術(shù)對海鮮進行水解以制取鮮味肽的常用手段有單一酶解法、復(fù)合酶解法及定向分段酶解法[7]。由于單一酶解及復(fù)合酶解技術(shù)都存在各自的不足而會限制底物酶解程度[8]。故實驗擬探究采用復(fù)合蛋白酶及風味蛋白酶雙酶定向分段酶解底物[6，9]的最優(yōu)工藝，因而試驗初期，需探究二次酶解的前期階段，即僅添加復(fù)合蛋白酶進行酶解的最佳工藝參數(shù)，使蛋白顆粒能夠被有效水解為肽片段，有助于后期加入風味復(fù)合酶而實現(xiàn)第二階段有效酶解[10]，如此可在保證傳統(tǒng)鮮味的同時，提高蛋白質(zhì)得率，便于人體吸收[9，11]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1材料 對蝦、沙丁魚，市售；復(fù)合蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、風味蛋白酶、中性蛋白酶，諾維信(中國)投資有限公司；濃硫酸、硼酸 、TCA、NaOH、CuSO4·5H2O、K2SO4、甲基紅、溴甲酚綠，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2儀器與設(shè)備 Mettler Toledo分析天平，上海衡平有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海一恒有限公司；F-4500型熒光分光光度計，日本Hitachi公司；GL-25MS 超速高速冷凍離心機，上海盛析儀器設(shè)備有限公司；超濾裝置，無錫賽普膜科技發(fā)展有限公司；KND2C型定氮儀，上海纖撿儀器有限公司；數(shù)顯臺式酸度計，上海浦春計量儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥儀，上海亞榮有限公司；PF6 原子熒光儀、TSA-986 原子吸收儀，北京普析有限公司；FDU-1200冷凍干燥機，日本東京Rikakikai公司；L-8900氨基酸分析儀，日本日立高科技有限公司；mersham蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)，美國曼德公司；Superdex peptide 10/300 GL分析柱，美國上海諾磁公司。

1.2 試驗方法

1.2.1酶解提肽方法 將原料進行解凍后粉碎，加入復(fù)合蛋白酶酶解3h，離心得上清液，取上清液備用，留待風味蛋白酶二次水解。

1.2.2酶解工藝流程[12]原料→解凍→粉碎→蝦魚醬→混合液→復(fù)合蛋白酶水解→滅酶→離心→過濾→取上清液→備用。

1.2.3基本指標測定 總氮量依據(jù)GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》方法測定[13]，氨基態(tài)氮含量根據(jù)ZBX 66038—1987《基態(tài)氮測定法》方法進行測定[14]。水解度的測定如式(1)所示，用以表征底物蛋白中被水解肽鍵數(shù)占肽鍵總數(shù)的百分含量[15]。

(1)

1.2.4響應(yīng)面試驗設(shè)計 在單因素試驗基礎(chǔ)上，確定復(fù)合蛋白酶酶解鮮味肽各單因素中合適的水平值范圍，根據(jù)響應(yīng)面中心組合及試驗設(shè)計[16-17]，以探究各單因素參數(shù)對響應(yīng)值的影響[18]。各酶解工藝參數(shù)酶添加量x1(%)、酶解時間x2(h)、酶解溫度x3(℃)及酶解pH值 x4作自變量，蛋白水解率作響應(yīng)值[19](表1)。

表1 因素水平編碼

1.2.5酶解液多肽分子量分布 取離心后酶解液上清液，通過Amersham 蛋白純化系統(tǒng)，Superdex peptide 10/300 GL分析柱，在洗脫液0.25 mol/L氯化鈉、0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液、pH 7.2、進樣體積50 μL、檢測波長214 nm、流速0.5 mL/min條件下[20]，進行酶解液多肽分子量分布測定。

1.2.6酶解液中氨基酸含量[21]稱取一定質(zhì)量樣品置于玻璃水解管，隨后加入6 mol/L HCl，抽真空并封管。使用水解器于110℃下進行24h水解。轉(zhuǎn)移定容后過濾，得濾液加以干燥成固態(tài)，樣品溶解于0.02 mol/L HCl并調(diào)整到合適濃度，利用氨基酸分析儀進行氨基酸類型與組成成分分析[22-23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗材料的基本成分測定

試驗材料成分見表2。

表2 試驗材料成分

2.2 最佳用酶的篩選

加酶量2%、酶解6h，根據(jù)不同酶的特性，選擇適宜的溫度和pH，以1∶3的料液比，以TCA可溶性氮的濃度來檢測不同酶的酶解效果。由圖1可知，5種酶均在最適宜的條件下作用，復(fù)合蛋白酶的水解能力較顯著[24]，水解度高達45%，綜合考慮，選擇復(fù)合蛋白酶作為分段酶解中第一段的酶制劑。

圖1 不同酶對可溶性氮酶解效果

2.3 復(fù)合蛋白酶酶解工藝參數(shù)

通過單因素試驗對復(fù)合蛋白酶作用時間、酶添加量、pH及溫度等工藝參數(shù)的優(yōu)化[25]，確定復(fù)合蛋白酶酶解的最適條件。

2.3.1復(fù)合蛋白酶酶解單因素試驗

(1)加酶量對酶解效果的影響：由圖2可知，在料液比調(diào)整為1∶10、酶解pH值7.5、作用時間3 h、溫度55°C水解條件下，水解度的變化趨勢呈現(xiàn)為先增加后降低。加酶量為3%時水解度最高，隨后加酶量雖有增加，但水解度并無上升趨勢，因此酶添加量選擇3%為宜。

圖2 加酶量對酶解效果的影響

(2)酶解時間對酶解效果的影響：由圖3可知，在料液比1∶10、pH值為7.5、加酶量為3%、溫度為55℃的水解條件下，水解度的變化趨勢為先升高后降低。時間為3 h時水解度最高，此后，雖增加酶解時間對水解度也并無明顯作用，故復(fù)合酶作用時間以3 h為最適。

圖3 酶解時間對酶解效果的影響

(3)溫度對酶解效果的影響：由圖4可知，在料液比1∶10、pH值為7.5、加酶量為3%、時間為3h時，隨著水解溫度的增加，水解度呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。考慮到水解效果及節(jié)約能耗，酶解溫度以55℃最佳。

圖4 酶解溫度對酶解效果的影響

(4)pH對酶解效果的影響：由圖5可知，在料液比1∶10、溫度為55℃、加酶量為3%、時間為3 h水解條件下，水解度的變化趨勢為先升高后降低。pH值為8時水解度最高。

圖5 pH對酶解效果的影響

2.3.2響應(yīng)面法優(yōu)化酶解條件

(1)復(fù)合蛋白酶酶解鮮味肽的響應(yīng)面試驗：以單因素試驗為基礎(chǔ)，依照Box-Behnken響應(yīng)面法的試驗要求，開展多組試驗(表3)。利用Design Expert軟件，以加酶量、酶解作用時間、溫度及pH作自變量，以蛋白的水解度作相應(yīng)指標進行回歸分析，獲取預(yù)測模型如式(2)：

Y=44.64+2.19X1+0.097X2-1.61X3-1.67X4+0.58X1X2-0.11X1X3-1.41X1X4+0.93X2X3+0.32X2X4+3.93X3X4-2.43X12-4.29 X22-3.10X32-3.24X42

(2)

表3 響應(yīng)方案及結(jié)果

表4 回歸與方差分析結(jié)果

表5 響應(yīng)面尋優(yōu)結(jié)果

(2)因素間的交互作用：由表5可知，交互項x3×x4對水解率的影響效果極為顯著，重點分析交互項BC對水解度(Y)的影響，固定模型中的加酶量x1=3%和酶解時間x2=3h，x3×x4交互作用的三維曲面圖與等高線圖見圖6。酶解溫度在逐步增加的過程中，水解度出現(xiàn)了先上升后降低的情況，且隨pH值增加，水解度也呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，這是由于隨著溫度及pH的改變，在酶最適合的溫度和pH范圍內(nèi)酶的活力達到最大，酶解越來越充分，呈鮮味的小分子短肽越來越多，當溫度繼續(xù)上升或pH超過最適值后，酶活力便會下降，酶解程度降低，水解程度也呈現(xiàn)出降低的趨勢。

圖6 交互項x3×x4對水解度的影響

2.3.3酶解液中多肽分子量分布的測定結(jié)果 研究表明，分子量較小的肽對食品的風味有較大的影響。由圖7可見，一次酶解液中多肽主要集中在3 000～5 000 Da以上，占到44.15%，大于10 000 Da肽段的比例最低，為4.67%。由此可知，通過復(fù)合酶水解能較好地降解海鮮中分子量大于10 000 Da的片斷，酶解產(chǎn)物中分子量主要分布在3 000～5 000 Da，使大分子量的肽分解成寡肽的轉(zhuǎn)化率更高，更有助于鮮味的體現(xiàn)。

圖7 一次酶解液的肽分子量分布(%)

2.3.4最佳條件下酶水解液中氨基酸的含量測定 表6表明，一次水解液的氨基酸含量豐富。

表6 酶解液內(nèi)氨基酸種類及含量

3 結(jié)論

本試驗確定復(fù)合蛋白酶初次酶解生產(chǎn)鮮味肽的最佳工藝參數(shù)為復(fù)合蛋白酶初次添加量3.3%、酶解溫度57℃、酶解時間3.5 h、pH 7.1，該條件下實現(xiàn)的雙酶解工藝使得水解率高達46.16%。復(fù)合蛋白酶的初步酶解工藝優(yōu)化將為后續(xù)探究風味蛋白酶二次酶解最優(yōu)工藝奠定理論基礎(chǔ)。◇

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Initially Production Technology of Protein Umami Peptide Compound Condiment

WANG Hong1，LIU Xin1，LI Jia-ni2，ZOU Xiao-shuang2，WANG Huan2，QI Bao-kun2，WANG Zhong-jiang2，JIANG Lian-zhou2

(1Heilongjiang GemChoice Food Co.，Ltd，Harbin 150060，China；2College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150060，China)

The protein flavor peptide produced by secondary hydrolysis technology could improve the protein yield effectively and be conducive to human absorption.The experiment according to the flavor characteristics of different water products，selected the sardine and shrimp as experimental material，the complex protease enzyme initially directional enzymolysis technology and ultrafiltration technology，preparation of peptide flavor improvement.The response surface method and the design of Box-Behnken to optimize the process of enzymatic hydrolysis of aquatic protein，the degree of hydrolysis was used as index to investigate the effects of enzyme addition，enzymatic hydrolysis temperature，time and pH on the yield of umami peptides.The optimal process conditions of enzyme preparation segmented umami peptides hydrolysis were compound protease hydrolysis enzyme amount 3.3%，temperature 57℃，hydrolysis time 3.5h，pH 7.1.

umami peptides；enzymatic hydrolysis；ultrafiltration

高品質(zhì)系列復(fù)合調(diào)味品加工技術(shù)研究與應(yīng)用(項目編號：2016DB3AS030)。

王 虹 (1980— )，女，本科，質(zhì)量工程師，研究方向：調(diào)味品研究與開發(fā)。

江連洲 (1960— )，男，博士，教授，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程。

(責任編輯 唐建敏)