腎康注射液中大黃素和大黃酚的含量測定方法研究

鄭宏亮

摘 要：目的：建立HPLC法測定腎康注射液中大黃素和大黃酚的含量方法。方法：菲羅門C18柱（250×4.6mm，5？滋m）；甲醇-0.1%磷酸溶液（82：18）為流動相；柱溫35℃；流速1.0ml·min-1；檢測波長254nm；進樣量：10μl。理論板數按大黃素峰計算應不低于3000。結果：大黃素在7.27μg·mL-1～145.30μg·mL-1濃度范圍內具有良好的線性關系，R=0.99996，大黃素平均回收率為99.07%，RSD（%）=0.52%；大黃酚在4.86μg·mL-1～97.10μg·mL-1濃度范圍內具有良好的線性關系，R=0.99998，大黃酚平均回收率為98.98%，RSD（%）=0.54%。結論：該方法準確、靈敏，可用于腎康注射液大黃素和大黃酚含量測定。

關鍵詞：腎康注射液；大黃素、大黃酚；HPLC

腎康注射液由大黃、丹參、紅花、黃芪四味藥材提取加工而成的中藥注射劑，主要是降逆泄濁、益氣活血、通腑利濕，適用于慢性腎功能衰竭屬濕濁血瘀證，癥見惡心嘔吐、口中粘膩、面色晦暗、身重困倦、腰疼、納呆、腹脹、肌膚甲錯、肢體麻木、舌質紫暗或有瘀點、舌苔厚膩、脈澀或細澀。為了嚴格控制本品質量，我們對主要成分大黃進行控制，大黃的有效成分中大黃素和大黃酚含量最高，參照藥典和結合本品特點，建立了HPLC法測定本品中大黃素和大黃酚的含量測定方法，并對建立的方法進行了方法學驗證試驗，具體如下：

1 試藥及來源

大黃素對照品（中檢所，批號：110756-200110），大黃酚對照品（中檢所，批號：110796-201017）；腎康注射液（市售樣品，規格：20ml/支）；甲醇為色譜純，磷酸為優級純，水為重蒸水，其它試劑為分析純。

2 儀器及色譜條件

高效液相色譜儀（島津20A）；菲羅門C18柱（250×4.6mm，5？滋m）；甲醇-0.1%磷酸溶液（82：18）為流動相；柱溫35℃；流速1.0ml·min-1；檢測波長254nm；進樣量：10μl。理論板數按大黃素峰計算應不低于3000。

3 對照品溶液、供試品溶液的制備

3.1 對照品溶液的制備：分別精密稱取大黃素、大黃酚對照品各適量，分別用甲醇溶解并稀釋制成每1ml含72μg大黃素、每1ml含48μg大黃酚的溶液。

3.2 供試品溶液的制備：精密量取本品2ml，置圓底燒瓶中，加水3ml，加8%的鹽酸溶液10ml，再加三氯甲烷10ml，加熱回流30分鐘，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取2次，每次10ml，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘渣加甲醇使溶解，轉移至25ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

4 線性關系考察

分別精密稱取大黃素對照品14.53mg、大黃酚對照品9.71mg，分別置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液。分別精密量取上述對照品貯備液各0.5、2.0、5.0、8.0ml，分別置10ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得不同濃度的對照品溶液，分別精密吸取10μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，分別對大黃素、大黃酚進行線性回歸，結果見表1、2。

結果表明，大黃素在7.27μg·mL-1～145.30μg·mL-1濃度范圍內線性關系良好；大黃酚在4.86μg·mL-1～97.10μg·mL-1濃度范圍內線性關系良好。

5 精密度試驗

取線性試驗關系考察項下大黃素濃度為72.65μg·mL-1和大黃酚濃度為48.55μg·mL-1的對照品溶液，分別精密吸取10μl，連續進樣6次，記錄色譜峰面積，結果連續進樣6次的峰面積相對標準偏差分別為0.18%、0.22%，儀器精密度良好。

6 重復性試驗

取同一批次樣品，按供試品溶液制備方法配制6份相同濃度的供試品溶液，照上述色譜條件，精密吸取10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算大黃素、大黃酚的含量，結果見表3。

結果表明，重復性試驗相對標準偏差小于2.0%，本方法測定大黃素和大黃酚含量的重復性良好。

7 回收率試驗

分別精密稱取大黃素對照品9.21mg、大黃酚對照品6.29mg，分別置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液。精密量取本品1ml，共9份，分別精密加入對照品貯備液0.8、1.0、1.2ml（分別相當于1ml本品含量的80%、100%、120%），每個濃度水平各3份，分別置圓底燒瓶中，加水8ml，加16%的鹽酸溶液10ml，再加三氯甲烷20ml，加熱回流30分鐘，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取2次，每次20ml，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘渣加甲醇使溶解，轉移至25ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。按上述色譜條件，分別精密吸取10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算大黃素、大黃酚的回收率，結果見表4、5。

結果表明，不同濃度下的大黃素和大黃酚平均回收率均在98～102%之間，相對標準偏差小于2.0%，該方法準確度高。

8 結論

本方法測定腎康注射液中大黃素和大黃酚含量，準確、可靠、重復性好，可用于本品的質量控制。

9 討論

本方法采用流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液（82：18），大黃素、大黃酚色譜峰與相鄰色譜峰分離度良好，峰形好，而本品采用藥典中大黃藥材方法的流動相，分離度達不到要求，不適合本品。加8%的鹽酸溶液10ml的目的是用酸水解的方法提取出大黃素、大黃酚，效果明顯。

參考文獻

[1]中華人民共和國藥典（一部）.化學工業出版社，2015：23-24.endprint