光基因技術調控星形膠質細胞釋放ATP和谷氨酸及其對阿爾茨海默病神經元保護機制的研究展望

柳浦青++何冰冰++陳鋒

[摘要] 阿爾茨海默病是中樞神經系統退行性病變之一，其病理機制主要是各種原因導致的神經元Aβ沉積，包括ATP和谷氨酸不足引起的Aβ沉積。應用光基因技術可以選擇性激活表達光敏感通道蛋白的星形膠質細胞，并促其釋放ATP和谷氨酸，從而阻斷由于ATP和谷氨酸不足引起的Aβ沉積。因此光基因技術有望應用于阿爾茨海默病的治療，并且避免藥物治療在非選擇性及廣泛不良反應方面的缺點。

[關鍵詞] 阿爾茨海默病；光基因技術；光敏感通道；三磷酸腺苷；谷氨酸

[中圖分類號] R338 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）11（a）-0040-04

The research progress in mechanism of optogenetics activated astrocytes release ATP and glutamate to protect neurons in Alzheimer′s disease

LIU Puqing HE Bingbing CHEN Feng

Department of Pharmacy， the Second Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medicine University Xinhua Hospital of Zhejiang Province， Hangzhou 310005， China

[Abstract] Alzheimer disease′s （AD） is one kind of degenereratly neuropathic disease. The pathomechanism of AD is the deposite of Aβ peptide， including ATP and glutamate insufficiency resulted Aβ deposite. Application of phogenetic technology can selectively activate astrocytes transfected with ChR2， promote the release ATP and glutamate， block the Aβ aggregation producing by insufficient of ATP and glutamate. Conclusion as a result， ChR2 mediated optogenetic technology can be used for AD treatment. This new treropeutical method will avoid the defects of non-selective and extensive side-effects.

[Key words] Alzheimer′s disease； Optogenetic technology； ChR2； ATP； Glutamate

阿爾茨海默病是以一種進行性發展的神經系統退行性疾病，尤其在65歲以上老人中多見。隨著全球老年化趨勢加重，阿爾茨海默病問題逐漸凸顯，對于該病的預防和治療也越來越受到重視。目前臨床上對于阿爾茨海默病的治療水平停留在藥物控制疾病進展水平，然而藥物的副作用多且廣泛，并非理想的治療方式。

光基因技術是將光敏感通道作為一種生物工具，可選擇性作用于特定細胞，引起相應的生理學功能。目前研究表明運用光基因技術可以選擇性激活星形膠質細胞，而星形膠質細胞的活動直接對神經元產生調控作用。如果通過光基因技術調控星形膠質細胞從而延緩神經元退行性病變，可彌補藥物治療存在的不足，為阿爾茨海默病患者提供新的希望。

1 ATP和谷氨酸對阿爾茨海默病神經元退行性病變的保護作用

阿爾茨海默病是一種神經退行性疾病，其病因和發病機制目前尚未完全明了。目前認為AD的病理改變主要表現為老年斑和神經元纖維纏結的形成，前者與β-淀粉樣蛋白（Aβ）的沉積有關。Aβ由淀粉樣蛋白前體物質APP分解而得，其中42/43肽的Aβ則是老年性斑塊中細胞外淀粉樣蛋白的主要成分，并且這種老年性斑塊和神經活動有關。APP在體內有兩種代謝途徑：若先經β分泌酶作用，產生sAPPβ和C99，C99再經γ分泌酶作用產生Aβ和AICD；若先經α分泌酶作用，產生sAPPα和C83，C83再經γ分泌酶作用產生p3和AICD。β分泌酶途徑產生的Aβ沉積損傷神經元細胞，而α分泌酶途徑產生的sAPPα對神經元產生神經營養和保護作用[1-2]。國內外研究表明，ATPα合成酶可以抑制Aβ介導的神經毒性損傷，并且抑制Aβ的聚集；而拮抗ATP合成的自身抗體則誘導神經元凋亡并損害小鼠的認知功能[3]。最近有研究發現，ATP等能量物質可有效增加APP的α分泌酶途徑，減少雙氧水、魚藤酮引起的能量缺失和氧化應激損傷，從而減慢阿爾茨海默病的疾病進展[4]。谷氨酸是中樞神經系統（CNS） 最主要的興奮性神經遞質，對正常腦功能和CNS疾病發揮重要的調節作用。研究表明谷氨酸作用于代謝型谷氨酸受體mGluR5促進sAPPα釋放，減少Aβ的沉積[5]。APP的加工理論認為，Aβ的產生與sAPPα的產生存在一種此消彼長的關系。sAPPα也具有保護谷氨酸和葡萄糖轉運體免受氧化應激損傷的功能，谷氨酸可以減少APP誘導的神經元樹突棘結構大量丟失，進一步補充突觸對谷氨酸攝取能力的不足[6]。

2 星形膠質細胞的活動及其分泌ATP、谷氨酸等神經遞質的意義

星形膠質細胞是CNS中主要的神經細胞，占大腦細胞數的90%。傳統研究認為其主要功能是對神經元其營養、支持和保護作用，但隨著研究的深入發現其還具有調控神經元信息傳遞功能[7-8]。星形膠質細胞對神經元的各種調控作用與其本身的活動息息相關，鈣波是星形膠質細胞活動的一種表現形式[9]。星形膠質細胞鈣波產生機制較復雜，有自發產生也有接受外界刺激后產生。鈣波起始時間，幅度及持續時間形式不規則也較難預測，表現形式為胞漿內鈣離子濃度或一過性升高或起伏變化或持續升高等。鈣波還可在細胞與細胞之間進行傳遞[10]。星形膠質細胞作為神經元輔助細胞，其包膜表面表達各種神經遞質受體和神經調質受體。當神經元突觸功能失調時，胞外的神經遞質和調質失衡。星形膠質細胞可被失衡的胞外環境激活，產生鈣波振蕩，釋放各種神經遞質并發揮相應的調控作用[11]。研究表明，激活的星形膠質細胞可以釋放多種神經遞質，例如ATP、谷氨酸、D-絲氨酸等[12-13]。這些遞質可與神經元上的神經遞質受體結合，對神經元產生各種調控作用。神經元上存在嘌呤受體，胞外核苷酸受體稱為P2受體，包括P2X和P2Y兩類。其中P2X受體是配體ATP門控的離子通道，P2X通道與胞外ATP結合時打開，讓特定的陽離子通過，激活下游信號，產生一系列生物效應[14-15]。ATP亦可通過神經元P2X通道進入細胞內，補充線粒體破裂引發的能量不足，減少氧化應激損傷[16]。谷氨酸是膠質細胞釋放的另一主要遞質，星形膠質細胞根據胞外環境釋放或者攝取谷氨酸，使其維持在相對穩定的水平[17-19]。釋放到胞外的谷氨酸作用于臨近的神經元谷氨酸受體包括謝型谷氨酸受體mGluR5、AMPA受體、NMDA受體、Kainate受體而引起神經元樹突棘形態和運動變化已多見報道[20-21]。谷氨酸作用于代謝型谷氨酸受體mGluR5促進sAPPα釋放，減少Aβ的沉積[5]。AMPA受體與Aβ誘導的突觸抑制和樹突棘丟失密切相關，通過穩定AMPA受體可能延緩阿爾茨海默病的發展[22]。endprint

3 光基因調控—Channelrhodopsin2選擇性激活星形膠質細胞的技術

光基因技術是目前國內外研究的熱點，對于研究神經回路研究有其獨特的優越性。既可避免電刺激的不精確性和侵入性，又可避免藥物作用非特異性[23]。其中光敏感通道Channelrhodopsin2是光基因技術中核心的技術工具之一。

3.1 基于光敏感通道Channelrhodopsin2的光基因技術

1991年研究者發現萊茵衣藻有趨光和避光反應，這種現象是由一種微生物來源的叫做視紫紅質的物質調節的。經過研究發現萊茵衣藻基因里有兩種視紫紅質的cDNA，Chop1和Chop2。Chop1和Chop2的本質是與微生物來源的視蛋白具有同源性的脫輔基蛋白，與視黃醛共價結合后分別形成Channelrhodopsin-1（ChR1）和Channelrhodopsin-2（ChR2）。ChR2是一個七次跨膜的非選擇性陽離子通道蛋白，在強光照射下通道打開，細胞外的陽離子進入細胞內形成離子流，該離子流即為光電流。ChR2在460 nm處有最大吸收波長，且對光照的反應極為迅速，強光照射下ChR2可以在幾個微秒內形成光電流。ChR2雖然是非選擇性陽離子通道，但是對不同的陽離子的通透性并不相同。根據離子半徑大小不同，ChR2對陽離子的通透性排列如下：Ca2+>Sr2+>Ba2+>Zn2+>Mg2+（≈0）。

ChR2主要有兩種結構，一種是737個氨基酸組成的全長蛋白ChR2-737，另一種是315個氨基酸組成的C端經過剪切的修飾蛋白ChR2-315，因為第316～715個氨基酸序列對于ChR2的光電流沒有任何影響。ChR2-315的cDNA能夠在動物細胞HEK-293和BHk內表達，并且在光照的誘導下可以產生相當大的光電流，這個電流足以使卵母細胞和HEK-293發生去極化。ChR2結構上通常帶有一個小分子的熒光蛋白，用來標記ChR2在細胞上的表達情況[24-26]。離子通道蛋白可對化學分子和電信號做出反應，而光敏感通道 Channelrhodopsin2能被特定波長（480 nm）的光線控制，而且該離子通道蛋白的反應程度取決于光刺激的強度和持續時間。因而可通過調節光刺激程序，調控該通道的開放程度，常規的物理或化學刺激手段很難解決這一問題[27]。

3.2 光敏感通道Channelrhodopsin2在星形膠質細胞上的表達應用

星形膠質細胞對發生退行性病變神經元的保護作用主要通過其活動產生的神經遞質ATP和谷氨酸實現。如何實現星形膠質細胞對神經元直接的調控作用，需要解決兩個技術問題：其一，選擇性激活混合培養的星形膠質細胞。細胞內鈣升高是星形膠質細胞活動的一個主要形式，是星形膠質細胞釋放信號分子的先決條件[28]。ChR2對Ca2+的通透性最大，對星形膠質細胞的活動意義重大。ChR2作為光基因調控技術手段的工具之一已經廣泛應用于神經系統研究。國內外研究發現通過選擇性光調控神經元放電和信息傳遞，已經達到改變動物認知獎賞行為、呼吸、睡眠覺醒等行為目的[29-32]。在星形膠質細胞轉染光敏感通道Channelrhodopsin2發現ChR2可以在星形膠質細胞表面穩定表達。用波長480 nm的藍光刺激膠質細胞，有效地激發了膠質細胞鈣波，并觀察不同刺激程序對星形膠質細胞鈣波形式的影響。其二，建立星形膠質細胞和神經元細胞混合培養的AD細胞模型，選擇性激活模型中的星形膠質細胞。在前期研究中實驗室所建立星形膠質細胞和神經元細胞混合培養模型為正常生理條件模型。為建立AD細胞模型，采用轉基因AD小鼠（Tg2576）。Tg2576小鼠在APP基因的表達、淀粉樣斑塊的形成、神經元的退變和記憶丟失等方面表現出許多與AD患者的相似性。Tg2576小鼠為AD的研究提供了理想的動物模型，其原代培養的神經元細胞用于神經元退行性病變的機制研究[33-35]。

4 展望

星形膠質細胞對神經元具有營養、支持、保護作用，其功能主要通過激發鈣波后釋放 ATP、谷氨酸、D-絲氨酸等神經遞質實現。星形膠質細胞對阿爾茨海默病神經元的保護作用雖早有報道，但是否通過激發星形膠質鈣波從而對神經元Aβ生成產生抑制尚不明確。過去科學家一直在尋找利用化學物質直接促進神經元交流，本研究運用光基因技術、熒光成像技術及分子生化技術，圍繞星形膠質細胞興奮能否保護退行性病變的神經元細胞展開，建立阿爾茨海默病細胞模型，探索其保護機制是否通過ATP/谷氨酸-sAPPα-Aβ分子信號通路實現。旨在探明星形膠質細胞活動對AD神經元的保護機制，為進一步開展阿爾茨海默病小鼠行為學實驗奠定基礎，為AD治療研究提供新方法和新思路。

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（收稿日期：2017-06-01 本文編輯：程 銘）endprint