連接SelS基因的攜P—選擇素單抗靶向微泡結(jié)合超聲治療早期糖尿病腎病的實(shí)驗(yàn)研究

王艷++李靜++黃瑞珠++黃萍++黃玉宇

[摘要] 目的 研究連接SelS基因的攜P-選擇素單抗靶向微泡結(jié)合超聲治療早期糖尿病腎病的效果。 方法 選取SPF級(jí)60只雄性SD大鼠為研究對(duì)象，制備2型糖尿病大鼠模型后隨機(jī)分為對(duì)照組、單純SelS組（SelS組）、SMBp組、超聲+SMBp組（UE+SMBp組），各15只。比較四組大鼠攝食量、攝水量、尿量、體重、空腹血糖、24 h尿蛋白、β2微球蛋白、血尿生化指標(biāo)及P-選擇素、AngⅡ、TGF-β1、SelS水平。 結(jié)果 四組大鼠治療前一般情況比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；四組治療后空腹血糖、24 h尿蛋白、β2微球蛋白水平、血尿生化指標(biāo)及P-選擇素、AngⅡ、TGF-β1、SelS水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 連接SelS基因的攜P-選擇素單抗靶向微泡結(jié)合超聲治療早期糖尿病腎病效果確切，安全性高，可作為防治早期糖尿病腎病的有效手段。

[關(guān)鍵詞] P-選擇素；單抗靶向微泡；糖尿病腎病

[中圖分類號(hào)] R587 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）11（a）-0015-05

Experimental study of monoclonal antibody targeted microbubble carrying P-selectin and connecting SelS gene in combination with ultrasound in treating early diabetic nephropathy

WANG Yan1 LI Jing2▲ HUANG Ruizhu3 HUANG Ping1 HUANG Yuyu2

1.Department of Geriatric Endocrinology， Guangzhou No.1 People's Hospital， Guangdong Province， Guangzhou 510180， China； 2.Department of Geriatric Nephrology， Guangzhou No.1 People's Hospital， Guangdong Province， Guangzhou 510180， China； 3.Department of Internal Medicine， 458th Hospital of Guangzhou Military Area， Guangdong Province， Guangzhou 510180， China

[Abstract] Objective To study the effect of monoclonal antibody targeted microbubble carrying P-selectin and connecting SelS gene in combination with ultrasound in treating early diabetic nephropathy. Methods A total of 60 specific pathogen free SD male rats were selected as the research objects to build type 2 diabetes rat models. Then the rat models were randomly divided into the control group， SelS group， SMBp group and UE+SMBp group， each group had 15 rats. The food intake， water intake， urine volume， body weight， fasting blood-glucose， 24 h urine protein， β2 microglobulin， blood and urine biochemical indexes， P-selectin， Ang Ⅱ， TGF-β1 and SelS levels of rats in the four groups were compared. Results Before treatment， the differences in general conditions of rats among the four groups were not statistically significant （P > 0.05）. The differences in fasting blood-glucose， 24 h urine protein， β2 microglobulin level， blood and urine biochemical indexes， P-selectin， Ang Ⅱ， TGF-β1 and SelS levels were statistically significant after treatment （P < 0.05）. Conclusion Monoclonal antibody targeted microbubble carrying P-selectin and connecting SelS gene in combination with ultrasound in treating early diabetic nephropathy has definite therapeutic effect and high safety， thus it can be used as an effective means for prevention and treatment of early diabetic nephropathy.endprint

[Key words] P-selectin； Monoclonal antibody targeted microbubble； Diabetic nephropathy

糖尿病腎病為糖尿病常見且嚴(yán)重程度最高的并發(fā)癥之一，已經(jīng)成為一個(gè)世界性公共健康問題。近些年來大量臨床研究表明免疫、炎性反應(yīng)在糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展之中扮演著至關(guān)重要的角色，但是僅僅通過控制血糖血脂、阻斷腎素-血管緊張素系統(tǒng)并不能夠取得理想效果，絕大多數(shù)患者依然進(jìn)展至終末期腎病[1]。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，靶向超聲分子成像技術(shù)逐漸引起了醫(yī)學(xué)界的高度關(guān)注，該技術(shù)通過對(duì)普通超聲微泡表面予以特殊處理，構(gòu)成靶向超聲微泡以直接作用于病變部位，使得療效顯著提高，與傳統(tǒng)治療方案相比較具有明顯優(yōu)勢(shì)[2]。鑒于此，本研究圍繞連接SelS基因的攜P-選擇素單抗靶向微泡結(jié)合超聲治療早期糖尿病腎病展開，報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，尿糖陰性，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK（京）2009～0018。所有大鼠周齡均為8周，體重190～210 g，平均（200±10）g。

1.2 試劑及儀器

鏈脲佐菌素，美國(guó)ENZO公司；二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素，美國(guó)Avanti Polar Lipids Inc；二棕櫚酰磷脂酰膽堿，德國(guó)Lipoid；聚乙二醇4000，德國(guó)AppliChem公司；普洛沙姆-188，德國(guó)巴斯夫集團(tuán)；抗生蛋白鏈菌素，美國(guó)西格瑪奧德里奇公司；生物素化抗大鼠P-選擇素單克隆抗體，美國(guó)BD公司；GCZZ型基因轉(zhuǎn)染治療儀，重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像研究所；羅康全優(yōu)越型血糖儀，德國(guó)羅氏公司；AU4800全自動(dòng)生化分析儀，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

1.3.1.1 飼養(yǎng)條件 所有實(shí)驗(yàn)用SD大鼠均采用籠養(yǎng)，按照每只籠2～3只飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的潔凈實(shí)驗(yàn)室之中，采用獨(dú)立通氣籠具。飼養(yǎng)溫度設(shè)定在20～24℃，相對(duì)濕度保持在60%～70%，每天實(shí)驗(yàn)用鼠光照以及黑暗時(shí)間各12 h[3]。飼養(yǎng)過程中所使用的籠具、飼料以及墊料均經(jīng)過高壓滅菌處理，試驗(yàn)期間所有的操作均于超凈工作臺(tái)進(jìn)行[4]。

1.3.1.2 動(dòng)物飼料 普通飼料：碳水化合物50%、脂肪10%、蛋白質(zhì)20%，總熱量為15.5 kJ/g；高糖高脂飼料：于普通飼料中加入20%蔗糖、10%豬油、2.5%膽固醇，使其成分含有碳水化合物51%、脂肪25%、蛋白質(zhì)14%，總熱量為20 kJ/g[5]。

1.3.1.3 糖尿病腎病大鼠模型制備 將60只實(shí)驗(yàn)用大鼠在普通飼養(yǎng)1周時(shí)間后改用高糖高脂飼料持續(xù)喂養(yǎng)4周，禁食不禁水12 h后向其腹腔內(nèi)注射小劑量鏈脲佐菌素30 mg/（kg·d），連續(xù)注射2 d后采用25%葡萄糖灌胃處理，每次灌胃劑量為2 mL，以預(yù)防模型制備期間出現(xiàn)低血糖反應(yīng)[6]。在持續(xù)灌胃3 d后檢測(cè)所有實(shí)驗(yàn)用大鼠隨機(jī)血糖，如果其數(shù)值均≥16.7 mmol/L亦或是24 h尿量超過模型制備前50%、24 h尿蛋白量>30 mg則表明2型糖尿病腎病模型制備成功[7]。如果檢測(cè)結(jié)果未滿足上述條件，可繼續(xù)以高糖高脂飼料喂養(yǎng)，直至符合條件為止。在所有糖尿病腎病大鼠模型均制備成功后采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、SelS組、SMBp組、UE+SMBp組，各15只。

1.3.1.4 超聲微泡的制備 將包括二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、聚乙二醇4000、普洛沙姆-188等在內(nèi)的脂質(zhì)材料水溶于75℃蒸餾水中，通全氟丙烷氣體，超聲振蕩至乳白色液體后靜置，去除下清液后加入等量的蒸餾水并將未結(jié)合的脂質(zhì)清除，重復(fù)4次后加入抗生蛋白鏈菌素，靜置條件下去除下清液2次后制備成為MB微泡[8-9]。向制備好的MB微泡中加入生物素化抗大鼠P-選擇素單克隆抗體，靜置過夜后去除下清液2次，置于4℃冰箱中待用[10]。將SelS質(zhì)粒經(jīng)由感受態(tài)大腸埃希菌予以轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增、內(nèi)毒素質(zhì)粒提取，通過XhoI內(nèi)切酶以及EcoRI內(nèi)切酶實(shí)施酶切[11]。選取制備好的MBp微泡3 mL以及濃度為1.5 g/L的SelS基因1 mL在4℃條件下混勻并靜置2 h，促使SelS基因充分黏附于MBp微泡外殼，從而制備成為SMBp微泡[12]。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)方法

經(jīng)大鼠尾靜脈分別注入同等劑量（1.5 mL/100 g）生理鹽水（對(duì)照組）、SelS微泡（SelS組）、SMBp微泡（SMBp組和UE+SMBp組）。除了UE+SMBp組外，其余三組均利用GCZZ型基因轉(zhuǎn)染治療儀對(duì)大鼠雙側(cè)腎組織實(shí)施照射，輻照劑量為2 W/cm2，連續(xù)脈沖持續(xù)時(shí)間為3 min。四組均給予30 d治療，隨后觀察治療效果[13]。

1.4 觀察指標(biāo)

包括攝食量、攝水量、尿量、體重；空腹血糖、24 h尿蛋白、β2微球蛋白；血尿生化指標(biāo)；P-選擇素、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）、SelS水平。其中，空腹血糖采用羅康全優(yōu)越型血糖儀進(jìn)行測(cè)定；24 h尿蛋白、β2微球蛋白、血尿生化指標(biāo)（尿素氮、肌酐、膽固醇、三酰甘油、糖化血紅蛋白、血清胱抑素）采用AU4800全自動(dòng)生化分析儀予以測(cè)定；采用ELISA法檢測(cè)大鼠血清P-選擇素、AngⅡ、TGF-β1、SelS水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組大鼠治療前后攝食量、攝水量、尿量、體重比較

治療前四組大鼠各項(xiàng)指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；治療后在攝食量、攝水量、尿量比較上，對(duì)照組>SelS組>SMBp組>UE+SMBp組，在體重比較上，對(duì)照組

2.2 四組大鼠治療前后空腹血糖、24 h尿蛋白、β2微球蛋白比較

治療前四組大鼠各項(xiàng)指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；治療后四組空腹血糖、24 h尿蛋白、β2微球蛋白比較，對(duì)照組>SelS組>SMBp組>UE+SMBp組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表2。

2.3 四組大鼠治療前后血尿生化指標(biāo)比較

四組大鼠治療前尿素氮、肌酐、膽固醇、三酰甘油、糖化血紅蛋白、血清胱抑素比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；治療后尿素氮、肌酐、膽固醇、三酰甘油水平，對(duì)照組SelS組>SMBp組>UE+SMBp組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表3。

2.4 四組大鼠治療前后P-選擇素、AngⅡ、TGF-β1、SelS水平比較

治療前四組大鼠P-選擇素、AngⅡ、TGF-β1、SelS水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），治療后P-選擇素、AngⅡ、TGF-β1、SelS水平，對(duì)照組>SelS組>SMBp組>UE+SMBp組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表4。

3 討論

由于糖尿病腎病存在著非常復(fù)雜的代謝紊亂問題，一旦病情未能夠得到有效控制而發(fā)展至終末階段，則其治療難度呈幾何增長(zhǎng)。所以及早診斷、及早有效治療成為阻斷病情持續(xù)惡化的關(guān)鍵所在[14-15]。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，靶向超聲分子技術(shù)日益成熟，通過對(duì)普通的超聲微泡進(jìn)行制備處理，將能夠直接作用于病變組織的特異配體與之結(jié)合，經(jīng)由靜脈注射后能夠充分利用靶向作用來促使特定分子長(zhǎng)時(shí)間黏附、聚集于病變部位，再輔之以超聲檢查，形成“主動(dòng)性靶向超聲分子成像”[16]。該手段能夠在病癥并未產(chǎn)生特異性臨床表現(xiàn)之前提示組織或器官受損程度，繼而為臨床早期干預(yù)治療工作開展提供指導(dǎo)依據(jù)，是其他傳統(tǒng)檢測(cè)手段以及影像學(xué)技術(shù)所無(wú)法比擬的。尤其是主動(dòng)性靶向超聲分子技術(shù)全程無(wú)創(chuàng)無(wú)痛，無(wú)論是敏感性還是特異性均處于較高水平，糖尿病腎病臨床診治工作中具有著廣闊的潛能，日益引起醫(yī)學(xué)界的重視與關(guān)注。

國(guó)外醫(yī)學(xué)研究表明，超聲微泡除了能夠?yàn)樵\斷工作提供幫助外，還可以作為基因或者是藥物的載體，將各種治療性藥物直接輸送至病變部位并采用高能量的超聲波將微泡擊碎，其所攜帶的藥物分子在靶區(qū)定點(diǎn)釋放，大幅提高病變部位或組織周圍血藥濃度，使得治療藥物作用時(shí)間更加持久[17]。此外，此種超聲靶向擊破微泡技術(shù)已經(jīng)在心血管系統(tǒng)的應(yīng)用中取得了理想的效果，進(jìn)一步證實(shí)了其有效性及實(shí)用性[18-19]。然而，時(shí)至今日尚未有將其應(yīng)用在糖尿病腎病治療工作中的報(bào)道，所以對(duì)此方面內(nèi)容加以分析和研究，無(wú)疑具有重要的研究?jī)r(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

本次研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，治療前后大鼠攝食量、攝水量、尿量、體重存在顯著差異，具體表現(xiàn)為模型制備后2型糖尿病腎病大鼠“三多一少”特征明顯。比較空腹血糖、24 h尿蛋白、β2微球蛋白、尿素氮、肌酐、膽固醇、三酰甘油、糖化血紅蛋白、血清胱抑素、P-選擇素、AngⅡ、TGF-β1、SelS水平，UE+SMBp組取得的治療效果優(yōu)于其他三組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。由上述研究結(jié)果表明，超聲靶向擊破微泡技術(shù)在此次動(dòng)物試驗(yàn)中取得了理想的治療效果，為糖尿病腎病治療提供了一種全新的思路和手段，尤其是該治療方案基因藥物在靶向組織處釋放過程中具有時(shí)間和空間的可控性，充分利用了微泡在超聲作用下產(chǎn)生的“聲孔效應(yīng)”，實(shí)現(xiàn)了基因藥物在多種生物膜之間的跨膜傳遞，進(jìn)一步提高了基因藥物的治療效果[20]。提示超聲微泡介導(dǎo)基因治療方案在糖尿病腎病臨床治療工作中具有著無(wú)限廣闊的應(yīng)用前景。但是，限制其在臨床推廣使用的因素仍然較多，其一在于經(jīng)濟(jì)因素，由于此種治療方案運(yùn)用了多種高尖端技術(shù)，使得其治療成本高昂，無(wú)法被絕大多數(shù)糖尿病腎病患者承受；其二該治療方案的有效性僅是通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，尚未進(jìn)行人體實(shí)驗(yàn)，所以尚需要大樣本、前瞻性實(shí)驗(yàn)研究予以支持。

綜上所述，連接SelS基因的攜P-選擇素單抗靶向微泡結(jié)合超聲治療早期糖尿病腎病效果確切，安全性高，可作為防治早期糖尿病腎病的有效手段。

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（收稿日期：2017-07-05 本文編輯：程 銘）endprint