克班寧長循環脂質體的包封率、體外釋放和穩定性研究

劉娜+王琪蕾++陳凌云++馬云淑

[摘要] 目的 研究克班寧長循環脂質體的包封率、體外釋放和穩定性。 方法 建立高效液相色譜法測定長循環脂質體中克班寧的含量；分別采用葡聚糖凝膠柱層析法和超濾離心法分離未包封克班寧，并對包封率和載藥量進行測定；采用透析法考察克班寧長循環納米脂質體的體外釋放行為；考察不同溫度和光照貯存條件下克班寧長循環脂質體外觀、粒徑和泄漏率。 結果 采用葡萄糖凝膠柱層析法分離游離克班寧測得包封率為79.46%，采用超濾離心法測得包封率為81.02%，克班寧長循環脂質體載藥量為5.6%；克班寧長循環脂質體體外釋放規律擬合為Higuchi方程：y = 0.1419 x1/2+0.1475，R2值為0.9338；在40 d內克班寧長循環脂質體在避光4℃冷藏條件下貯存穩定。 結論 超濾離心法操作簡單，重現性好，所制得的脂質體具有明顯的緩釋釋放特征，需避光冷藏貯存。

[關鍵詞] 葡聚糖凝膠柱層析法；超濾離心法；包封率；載藥量；透析法

[中圖分類號] R284.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）11（a）-0004-05

Study on entrapment efficiency， drug release in vitro and stability of Crebanine long circulating liposome

LIU Na WANG Qilei CHEN Lingyun MA Yunshu

Yunnan University of TCM， Yunnan Province， Kunming 650500， China

[Abstract] Objective To study the entrapment efficiency， drug release in vitro and stability of Crebanine long circulating liposome. Methods The concentration of Crebanine in long circulating liposome was determined by high performance liquid chromatography. The liposome and free Crebanine were separated by the sephadex gel column chromatography and the centrifugal ultrafiltration， the entrapment efficiency and drug loading were determined. The release behavior of the drug from liposome was studied by the dialysis method. The liposome appearance， particle size and leakage rate were studied by the effects of different temperature and light storage. Results The entrapment efficiency was 79.46% by the gel column chromatography and 81.02% by the centrifugal ultrafiltration. Crebanine long-circulating liposome drug loading was 5.6%； the Higuchi equation of Crebanine long-circulating liposome in vitro release was y = 0.1419 x1/2+ 0.1475， the R2 value was 0.9338； Crebanine long-circulating liposome was stabilized in the avoid light of 4℃ under refrigeration. Conclusion The centrifugal ultrafiltration is simple and reproducible. The prepared liposome is typical sustained-release， the liposome needs to be kept in cold storage.

[Key words] Sephadex gel column chromatography； Centrifugal ultrafiltration； Entrapment efficiency； Drug loading； Dialysis method

克班寧（Crebanine）分子量為339.38，分子式為C20H21NO4，屬于阿樸菲類Aporphine（Ap）生物堿[1-2]，研究表明其有顯著的抗心律失常作用，但起效快，作用時間短，治療窗窄，限制了克班寧的應用，將其制備成長循環脂質體，有望改變傳遞和釋放方式，提高療效，降低毒性。本研究建立了HPLC法測定脂質體中克班寧的含量；以包封率和載藥量為評價指標，考察不同的分離方法；采用透析法考察脂質體的體外釋放方式；進行穩定性研究，為克班寧長循環脂質體（Cre-LCL）質量標準研究提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

winner-801納米激光粒度儀（濟南微納顆粒儀器股份有限公司）；SK250HP超聲清洗儀（上海科導超聲儀器有限公司）；RV28旋轉蒸發儀（德國，艾卡）；BT25S分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；WFZ-UV2000紫外分光光度計（龍尼柯儀器有限公司）；層析柱（上海錦華層析設備廠）；Agilent1100高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；迪馬C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；透射電子顯微鏡（日本JEM-2001）；迷你擠出器（Avanti公司mini-extruder）；超濾離心管（德國默克Millipore）；RCZ-1A型溶出實驗儀（上海黃海藥檢儀器廠）等。endprint

1.2 試藥

克班寧（自制，含量為98%）；大豆磷脂（上海太偉藥業有限公司，批號：20140202）；膽固醇（上海伯奧生物科技，批號：130409）；聚乙二醇2000（天津市大茂化學試劑廠，批號：20130617）；硫酸銨（天津市大茂化學試劑廠，批號：20120302）；氫氧化鈉（天津市大茂化學試劑廠，批號：21040312）；葡聚糖凝膠SephadexG-50（規格100～300 μm，Solarbio公司，批號：727A064）；聚碳酸酯微孔濾膜（Whatman公司，批號：131135012E）；透析袋（USA進口分裝，截留分子質量10～14 kD，昆明寶信生物技術有公司）；色譜甲醇（默克公司，批號：211670）；純水。其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 含量測定

建立HPLC法[3-4]測定Cre-LCL中克班寧的含量。

2.1.1 溶液制備

精密稱取克班寧0.3 g置于100 mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品；取克班寧長循環脂質體1 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇超聲溶解，并稀釋至刻度，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續濾液，作為供試品；精密稱取卵磷脂3.3 mg、膽固醇0.67 mg、聚乙二醇2000 1.1 mg置于10 mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即為空白脂質體，作為陰性對照品。

2.1.2 色譜條件

十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（4.6 mm×250 mm， 5 μm），流動相以甲醇-0.008%三乙胺水（75∶25）；流速1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測波長280 nm。

2.1.3 專屬性

色譜圖中（圖1），樣品中有1個色譜峰與克班寧標準品色譜峰的保留時間一致，陰性樣品的色譜圖中在與標準品相同保留時間（±5%）位置上沒有吸收峰，分離度為9.1，理論塔板數大于5000，符合《中國藥典》一部附錄ⅥD高效液相色譜法（HPLC）項下規定，本法測定其含量靈敏度高，專屬性強。

2.1.4 線性關系考察

取“2.1.1”下克班寧對照品適量，加甲醇稀釋定容得到克班寧系列對照品溶液。分別精密吸取10 μL注入液相色譜儀，照“2.1.2”項下色譜條件測定峰面積，以峰面積（A）為縱坐標，進樣量（C）為橫坐標，繪制標準曲線，并計算回歸方程。結果克班寧的回歸方程為A = 37.168C-348.46（R = 0.9994），線性范圍為0.06～1.8 mg/mL。

2.1.5 精密度

分別精密吸取“2.1.2”項下供試品溶液各10 μL，重復進樣6次，測定峰面積，RSD為0.007 924%。

2.1.6 穩定性

取“2.1.2”項下供試品溶液，在0、2、4、6、8 h分別進樣10 μL，測定峰面積，RSD為0.024 33%，克班寧溶液在8 h內穩定。

2.1.7 重復性

取批號140510克班寧長循環脂質體樣品，按“2.1.1”項下供試品制備方法精密制備6份，分別進樣10 μL測定含量，結果RSD為0.303%。

2.1.8 加樣回收率

取“2.1.1”項下的對照品溶液精密量取3 mL分別用甲醇定容于10、50、100 mL的容量瓶中，配得高（881.1 μg/mL）、中（440.55 μg/mL）、低（88.11 μg/mL）克班寧對照溶液。分別取克班寧對照溶液高、中、低濃度各2 mL置于10 mL容量瓶中，再分別加入克班寧脂質體樣品（2.807 mg/mL）3 mL于容量瓶，用甲醇定容，搖勻，經微孔濾膜（0.4 μm）過濾后再分別取10 μL注入液相色譜儀，照該品含量測定方法，測定含量，計算平均回收率為101.56%，RSD值為6.77%。見表1。

2.2 包封率測定

參考相關文獻[5]，結合自身實驗條件，包封率測定選擇了適用性強的凝膠柱法和超濾離心法進行比較。本研究分別采用葡聚糖凝膠柱層析法和超濾離心法[6]分離未包封克班寧，并對包封率和載藥量進行測定[7-8]。

2.2.1 葡聚糖凝膠柱層析法

分別精密取1 mL Cre-LCL兩份，一份加入50 mL容量瓶中，量取5 mL破膜劑，破壞磷脂雙分子膜，用pH=7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）溶液定容[9]，經0.45 μm濾膜過濾后用“2.1”項下方法測得濃度C1；另一份加入葡聚糖凝膠（SephadexG-50）凝膠層析柱頂端，經層析柱分離，根據洗脫曲線收集[10]洗脫液前26 mL，置于50 mL容量瓶中，再加入5 mL破膜劑，搖勻，甲醇定容，經0.45 μm濾膜過濾后用“2.1”項下方法測得濃度C2。包封與未包封的的總藥量W總=C1×V，包封的藥量W包封=C2×V，包封率E%=W包封/W總×100%。

2.2.2 超濾法

2.2.2.1 超濾離心管截留量的選擇 分別取10、30、100 kD截留量的超濾離心管，精密量取0.2158 mg/mL克班寧溶液10 mL，在4000 r/min下離心30 min，取濾液，0.45 μm濾膜濾過，取續濾液，HPLC法測峰面積，同時以測得0.2158 mg/mL克班寧溶液峰面積為分母，測定透過率。截留量為10、30、100 kD的透過率分別為66.02%、82.96%和95.54%。其中100 kD超濾離心管對克班寧透過率最高，10 kD和30 kD超濾膜上附著不同程度藥物結晶，10 kD的最多。

2.2.2.2 離心時間的確定 分別精密量取0.2158 mg/mL克班寧溶液10 mL加入到100 kD超濾離心管中，4000 r/min分別離心30、60、90 min。取濾液，0.45 μm濾膜濾過，取續濾液，HPLC法測得峰面積，同時以測得0.2158 mg/mL克班寧溶液峰面積為分母，測定透過率。離心30、60、90 min的透過率分別為95.45%、97.60%、98.02%。最終確定超濾離心時間為60 min。60 min的透過率較30 min高，而90 min的透過率較60 min的高，但由于離心時間過長會產熱，溫度升高影響藥物脂質體穩定性，綜合考察后確定離心時間為60 min。endprint

2.2.2.3 超濾法測定包封率 分別精密量取1 mL Cre-LCL兩份，一份加入10 mL容量瓶中，量取1 mL破膜劑，破壞磷脂雙分子膜，用pH=7.4的PBS溶液定容，經0.45 μm濾膜過濾后用“2.1”項下方法測得濃度C1。另一份置于10mL容量瓶，用pH=7.4的PBS溶液定容，然后放于截留分子量100 kD超濾離心管中，在常溫下4000 r/min離心1 h，取超濾液經0.45 μm過濾后進樣，用“2.1”項下方法測得濃度C2。包封與未包封的的總藥量W總=C1×V，游離的藥量W游離=C2×V，包封率E% =（1-W游離/W總）×100%。

2.2.3 包封率測定結果

取同一份樣品分別按照“2.2.1”和“2.2.2”項下分離方法分離并測定其包封率，結果見表2。從表2結果看出，葡聚糖凝膠柱對脂質體和游離藥物分離有吸附，耗時長，Cre-LCL溶液經過凝膠洗脫分離被稀釋，使藥物濃度降低。超濾離心管成本偏高，但具備操作簡單、用時短、將分離與濃縮同步進行等特點。用超濾離心方法的分離未包封的克班寧可得到濃度較高Cre-LCL溶液。

2.3 載藥量

按比例精密稱取的PEG2000、磷脂和膽固醇，總質量M，按照工藝制備成Cre-LCL溶液，經過超濾離心分離游離的藥物后得到Cre-LCL的體積為V，將Cre-LCL溶液按照“2.1”項下方法測定克班寧的濃度C，載藥量%=CV/（M+CV），得到載藥量為5.6%。

2.4 體外釋放實驗

本研究參考文獻[11-13]采用透析法考察克班寧長循環納米脂質體的體外釋放行為。取Cre-LCL脂質體混懸液10 mL，裝入透析袋中，固定在溶出儀攪拌槳上，置于0.1 mol/L pH值7.4的等滲PBS緩沖液200 mL中[14]，按中國藥典“溶杯法”測定。溫度控制在（37±1）℃，轉速為100 r/min。分別在時間點5 min、10 min、20 min、30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h、10 h、12 h、24 h、36 h，精密取1 mL釋放介質溶液，經0.45 μm濾膜過濾后用“2.1”項下HPLC法測定含量，同時迅速補充相同體積的釋放介質。以最大溶出量為對照，計算各時間點的溶出度（%），以時間為橫軸繪制的釋放曲線見圖2。

根據體外釋放曲線和相關數據將克班寧長循環脂質體體外釋放模型用origin8.0進行擬合，以確定是那種釋放模型，結果見表3。從表中可知，Higuchi方程的R2值更高，故克班寧長循環脂質體體外釋放度符合Higuchi方程的規律，具備緩釋制劑的特點。Cre-LCL在3 h的釋放量是38.93%，滿足藥典中脂質體制劑指導原則對于脂質體在0.5 h內突釋量小于40%的規定。

2.5 穩定性研究

取同一批克班寧長循環脂質體，測定包封率和粒徑之后，取2 mL體積熔封在安瓿瓶中，分為4組，分別貯存在室溫、室溫避光，4℃和4℃避光的環境下，在10、20、40 d的時候取出觀察外觀，測定粒徑和包封率，并根據公式[15]

測定泄漏率，結果見表4。從表中總結得出：Cre-LCL對溫度敏感顯著，對光線敏感一般。室溫（20℃）下，Cre-LCL不穩定，泄漏率高，貯存時間延長，脂質體凝聚現象明顯，凝聚成團后，脂質體體系破壞；低溫4℃冷藏下，Cre-LCL穩定，泄漏率低，在40 d內，脂質體無顯著的凝聚現象。在避光條件下，Cre-LCL更穩定。

3 討論

實驗建立了克班寧長循環脂質體性質和質量考察的方法，為Cre-LCL的處方、工藝篩選、優化等實驗提供質量評價依據。

在建立HPLC法測定Cre-LCL中克班寧的含量時，因脂質體材料特殊（大豆卵磷脂和膽固醇易形成囊泡，堵塞色譜柱[16-20]），對溶劑進行考察。分別考察了異丙醇、乙醇和甲醇的溶解性，甲醇超聲溶解效果好，故選用甲醇作為溶劑。

在包封率測定中，對葡聚糖凝膠法和超濾離心法進行了考察。葡聚糖凝膠法適用性強[21-22]，但本研究中Cre-LCL和游離克班寧的洗脫曲線較接近，同時，洗脫過程稀釋了Cre-LCL濃度，對后續的藥動學試驗造成濃度過低的難題。綜合考慮后，采用超濾離心法進行包封率測定，省時實用。但脂質體分離中，需特別關注離心過程中的產熱現象對脂質體的影響，離心時間不宜過長。

在穩定性實驗中，因克班寧見光或受熱易氧化變紅，故考察了光和溫度對Cre-LCL的影響并對泄漏率進行測定。依據泄露率的計算公式，測量的包封率大于制備時包封率，計算得到泄漏率為負值，可認為沒有發生泄漏。穩定性實驗結果表中，40 d的4個條件下的包封率均高于20、10 d和0 d，本研究分析Cre-LCL在貯存時，脂質體囊材之間發生凝聚，將游離的克班寧吸附或包裹在囊材之間，放置時間越長，越利于克班寧吸附或包裹，故造成40 d時包封率高于制備時，無法測得泄漏率。同時，結果顯示Cre-LCL脂質體凝聚成團后，顏色沒有變紅，說明克班寧包裹在脂質體囊材中減小氧化，增強了穩定性。

本研究嘗試將Cre-LCL冷凍干燥制成固體便于保存，理論上應得到白色松泡狀粉末[23]，但制得黃色類似磷脂狀的黏稠固體，故冷凍干燥法制備脂質體還有待進一步深入研究。

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（收稿日期：2017-08-02 本文編輯：張瑜杰）endprint