MTS法檢測番鴨呼腸孤病毒對鴨胚成纖維細胞活力的影響

林澤鑫

福建省平和縣動物疫病預防控制中心 福建平和 363700

MTS法檢測番鴨呼腸孤病毒對鴨胚成纖維細胞活力的影響

林澤鑫

福建省平和縣動物疫病預防控制中心 福建平和 363700

采用MTS法檢測接種不同致病力番鴨呼腸孤病毒12 h、24 h、36 h、48 h、72 h、96 h后對番鴨鴨胚成纖維細胞（MDEF）活力的影響。根據細胞病變情況和活力狀態確定細胞發生變化的拐點，初步探討番鴨呼腸孤病毒感染誘導細胞凋亡的發生和細胞活力的特征變化，進一步了解番鴨呼腸孤病毒與宿主之間的相互關系，為研究番鴨呼腸孤病毒感染和致病機理提供時間科學依據。結果表明，接毒后36 h，細胞活力達到最高，高致病力YB毒株作用于MDEF，細胞活力在48 h大幅下降并出現明顯細胞凋亡；低致病力YJL毒株作用于MDEF，則在72 h可出現明顯細胞凋亡。

MTS檢測法 番鴨呼腸孤病毒 番鴨鴨胚成纖維細胞（MDEF） 細胞活力

番 鴨 呼 腸 孤 病 毒 （Muscovy duck reovirus，MDRV）可引起番鴨以肝脾出現灰白色壞死點（白點病、肝白點病、花肝病）、纖維素心包炎為主要特征的一種急性傳染病，臨床癥狀體現為番鴨軟腳、腹瀉、生長障礙，該病也感染鵝。番鴨呼腸孤病毒感染也是我國近年來才出現的較為流行的番鴨疫病，該病發病率高（30%～90%），致死率高（60%～80%）[1]。番鴨呼腸孤病毒引發的番鴨疫病主要發生于40日齡以下番鴨，以7～45日齡常發，且日齡越小，病死率越高，發病鴨耐過后變成僵鴨[2-3]，并且治療該病至今無特效藥。番鴨呼腸孤病毒是呼腸孤病毒科（Reoviridae）正呼腸孤病毒屬（Orthoreovirus）的成員，病毒粒子呈正二十面體對稱，無囊膜，有雙層衣殼結構。完整的番鴨呼腸孤病毒粒子直徑60～75 nm，氧化銫中的浮密度為1.36～1.37 g/mL，有空心、實心兩種病毒粒子。病毒基因組為分界的雙股RNA，在SDS-PAGE中，其核酸型具有禽呼腸孤病毒的特征，即由大小不同3個類別 （大節段L、中節段M和小節段S0）的10個節段組成；該病毒目前得知編碼14種蛋白，其 中 結 構 蛋 白 10 種 ：λA、λB、λC、μA、μB、μBC、μBN、σC、σA、σB；非結構蛋白,4 種：μNS、P10、P17、σNS）[4]。國內外自報道番鴨呼腸孤病毒病以來，針對該病病原學、病理形態學以及分子生物學診斷及核酸序列等方面的研究已取得較大進展，但對番鴨呼腸孤病毒病的發生、發展與轉歸機制了解較少。本文通過檢測番鴨呼腸病毒對番鴨鴨胚成纖維細胞（MDEF）活力的影響來研究感染機制，為進一步明確該病且更好地防治該病提供研究思路與研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 番鴨鴨胚 （購自莆田廣東溫氏家禽有限公司，由其實驗室孵化）、RPMI1640粉末培養基（GIBCO 公司）、MTS 試劑盒（Promega 公司）、新生牛血清（浙江天杭生物科技）、1%雙抗（青霉素、鏈霉素購自華北制藥集團）。

1.1.2 主要器材 96孔板、CO2培養箱 （Thermo公司）、酶標儀（Thermo公司）、電熱恒溫箱（上海陽光實驗儀器公司）、超凈工作臺（SW-CJ-LC標準型）、恒溫水浴鍋（上海精宏試驗設備有限公司）、微型振蕩器（上海人和科學儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 番鴨原代成纖維細胞的制備 在無菌條件下取出13日齡番鴨胚體，放入含有1%雙抗Hanks液的培養皿中；將胚體的頭部及四肢剪去，并去除胚體的心臟、肝臟、腸道等內臟器官；用hanks液將胚體沖洗干凈放入20 mL青霉素瓶中；用彎頭剪刀將其剪至1 mm3大小的碎塊后，再次用Hanks液對組織進行洗滌 （一般需要洗兩遍組織上清才能清亮）；隨后用不含EDTA的0.25%胰酶對其進行37℃水浴消化（胰酶使用量一般為4 mL/胚，胰酶的體積是被消化組織體積的4倍）；水浴過程每3 min振蕩1次，3次后無菌條件下取出上清 （胰酶），加入15 mL含有10%血清、1%雙抗的1640培養液終止消化；用彎頭滴管輕輕吹打（每枚胚需吹打15次左右即能獲得理想細胞量）、靜置（5～8 min）、過濾（使用滅菌過的200目細胞過濾網）；白血球計數法計數后稀釋至5×105/mL，分裝至培養瓶中于37℃、5%CO2培養箱中培養，待用。

1.2.2 96孔板培養細胞及培養YB株和YJL株病毒 將兩毒株在胚體上重新傳代是為了復壯所保存的病毒，以期恢復其原有的毒力并達到穩定；在細胞上傳代培養是為了將保存的病毒株在宿主細胞增殖，大量擴增后續試驗所需要的病毒，做到試驗前后病毒沒有差異。

1.2.2.1 兩毒株在番鴨胚體上的傳代 選取胚體狀態正常的7日齡番鴨胚，分別在兩個操作臺對兩毒株進行接毒。無菌條件下對胚體進行卵黃囊接種，每枚胚接種0.4 mL病毒量；用紅蠟封好，置于37℃生化培養箱培養；每天翻蛋4次，照蛋3次，棄去接毒24 h內死去的胚 （認為非正常死亡）；胚死后放入4℃冰箱8 h或過夜后無菌收取胚體和尿囊液，研磨后裝入20 mL青霉素瓶，-70℃冰箱保存備用。

1.2.2.2 兩毒株在MDEF上傳代擴增 在已經培養24 h的MDEF原代細胞上（已基本鋪滿單層）接毒，分別在兩個超凈臺中進行。操作步驟如下：用彎頭滴管輕輕吹打細胞表面，洗去漂浮的死亡細胞后棄上清，加入少量含有1%雙抗的Hanks液再次洗滌細胞表面，盡量減少血清對病毒吸附細胞的影響；加入1 mL病毒液置于37℃、5%CO2培養箱感作45 min；爾后加入含2%血清、1%雙抗的1640維持液，置于37℃、5%CO2培養箱培養，設空白對照組，每日觀察病變。

1.2.3 MTS法檢測接種YB毒株和YJL毒株后番鴨MDEF的活力 MTS檢測方法是檢測細胞增殖、細胞毒性的常用方法[5-6]。具體方法與步驟如下：（1）培養番鴨原代成纖維細胞到對數生長期。（2）取96孔細胞培養板， 每孔加 0.1 mL 含 1×104～2×104上述細胞之一的DMEM培養液（加10%小牛血清）。（3）每孔加0.1 mL系列稀釋的待測細胞因子，在37℃、5%CO2的飽和水汽二氧化碳培養箱中培養24 h。（4）每孔加20 μL MTS/PMS混合液，繼續培養3～4 h，顯色。（5）檢測前搖晃培養板 10 s，混勻顏色。在490 nm處酶聯檢測儀檢測各孔的光吸收值（OD）。用樣品稀釋度對OD值繪制劑量-反應曲線，根據標準品曲線計算樣品中細胞因子的量。

檢測孔包括空白組、0加藥組、加藥組，空白組為只有1640培養基孔，0加藥組為正常細胞未接種病毒組，加藥組為接種病毒組。按照公式計算：細胞活力（%）=[A（加藥）-A（空白）]/[A（0 加藥）-A（空白）]×100%，其中 A 為 OD 值。

2 結果與分析

選用生長狀態優良的13日齡番鴨胚，制備原代成纖維細胞（6板96孔），每孔細胞數量 5×104個，分別接種YB、YJL毒株高低兩個劑量梯度，記作YB-H、YB-L、YJL-H、YJL-L，接毒劑量見表1。高劑量梯度為所加病毒能夠完全覆蓋細胞層表面，低劑量梯度為所加病毒經過搖晃可浸過細胞層表面。于96孔細胞培養板接毒后 12 h、24 h、36 h、48 h、72 h、96 h 各取一板，MTS法對1640培養液孔、空白細胞孔、YB毒株接毒孔、YJL毒株接毒孔進行DMEM活力檢測，在490 nm處用酶標儀讀取OD值。每組分別檢測8個重復孔，去掉最高值和最低值，其余求和取平均值，即為最終的OD值，檢測結果見表2。

表1 試驗中選擇的接毒劑量

表2 MTS法檢測細胞活力（OD值）

以空白組活力最高時的A值（空白）作參照，根據公式計算細胞活力，結果見表3；并根據活力表作出組間活力比較折線圖（見圖1），組內活力比較柱狀圖（見圖2）。由MTS檢測得出的細胞活力折線圖和組內各時間細胞活力圖可以看出，空白組細胞活力從12 h至36 h呈現上升趨勢。分析認為這是由于鴨胚原代成纖維細胞在該期間處于生長和少量增殖狀態，成纖維細胞為終末分化細胞，不具備很高的增殖能力，與雞胚相比，番鴨胚的成纖維細胞增殖能力更弱；36 h之后細胞活力逐漸下降，存活時間在120 h左右。

表3 各組細胞活力水平

圖1 組間細胞活力折線圖

圖2 組內細胞活力柱狀圖

YJL-L組因病毒含量較少、毒力較弱，其細胞活力與空白組趨勢一致，整體上細胞活力稍微低于空白組。YJL-H組、YB-L組、YB-H組細胞在生長趨勢上大體一致，于36 h同樣處于活力最高狀態，符合病毒為了在機體內復制而激活宿主的生長因子，以更好地建立感染條件的原理；細胞活力在48 h明顯下降，認為此時細胞啟動凋亡機制，使相當部分感染細胞死亡，造成活力下降；72 h可檢測到活力有小幅提升，分析認為因細胞凋亡使部分病毒被消滅，使得其他細胞受病毒感染的比例減少，顯示細胞凋亡對機體的積極意義，由于受到過多病毒的感染，細胞凋亡數量較大，使機體免疫受到抑制，細胞仍有死亡，因而在96 h依然出現活力下降的明顯現象。YJL-H組整體而言活力高于YB組，分析認為YJL是低致病力毒株，雖然選用高劑量，因與雞源呼腸孤病毒基因序列同源性高達96%以上，可懷疑原宿主為雞，由于宿主更替，致病能力因此改變，在番鴨宿主上呈現低致病狀態，但毋庸置疑，YJL仍然具有一定的致病力。而YB-H與YB-L組之間，在細胞活力和趨勢上只有少許差異，可見即便宿主被少量該高致病力毒株感染，也會造成高致病狀態。

3 討 論

番鴨呼腸孤病毒病給養殖業造成很大的經濟損失，由于該病引起免疫器官淋巴細胞發生病理變化，進而導致免疫抑制。據此，早期進行預防是防治該病的關鍵。研究接種不同致病力MDRV之后各個時間點的MDEF活力，為致病機理的研究提供數據基礎，對未來根據致病機理進行防治十分必要。

細胞凋亡是基因控制的、細胞的自然死亡，也是有多因素和多種通路參與的過程。檢測時不能根據單一指標來判斷細胞凋亡，一般需要同時檢測三個以上指標，互相驗證，以保證檢測的準確性；而保證準確的前提則需要對凋亡事件選取不同的時間進行檢測，與此同時，更要設置好高質量的陰性對照組，避免出現假陽性或者假陰性。

在本試驗中，不同致病力MDRV毒株YB和YJL毒株對細胞凋亡的影響是顯而易見的，通過各種定性和定量的方法互相驗證出誘導凋亡的時間和水平。在對系列時間點MDEF活力和凋亡水平影響的檢測中，MDEF活力在接毒后36 h達到最高，高致病力YB毒株使MDEF在48 h出現明顯凋亡，低致病力YJL毒株使MDEF在72 h出現明顯凋亡。在對番鴨組織器官（肝臟和脾臟）的細胞凋亡檢測中，YB毒株對肝臟細胞的致凋亡作用尤為凸顯。

在獲得兩毒株誘導細胞凋亡最佳時間和水平數據后，可以在后續試驗中對細胞凋亡信號通路的研究提供借鑒。在該時間點上可檢測相關蛋白的活性，如Caspase 9活性、Caspase 8活性、Bap31等，以確定不同致病力MDRV誘導細胞凋亡主要是內源線粒體通路、外源死亡受體通路還是內質網通路，然后再判斷各通路具體的分子調控機制。如此，不同致病力MDRV毒株在致病機理上的異同便日漸顯現，根據致病機理防治番鴨呼腸孤病毒病，將取得事半功倍的效果。

[1]林鋒強,朱小麗,陳少鶯,等.番鴨呼腸孤病毒分子流行病學研究[J].福建農業學報,2012,27(3)：217-221.

[2]胡奇林,陳少鶯.番鴨呼腸孤病毒病(肝白點病)研究進展[J].福建畜牧獸醫,2004,26(z1)：7-9.

[3]林鋒強,朱小麗,陳少鶯,等.番鴨呼腸孤病毒在番鴨體內的動態分布和排毒規律[J].福建農業學報,2011,26(3)：335-337.

[4]胡奇林,林鋒強,陳少鶯,等.應用RT-PCR技術檢測番鴨呼腸孤病毒[J].中國獸醫學報,2004,24(3)：231-232.

[5]杜偉偉.MTT檢測腎疏寧含藥血清對大鼠腹膜間皮細胞的作用[J].中國中西醫結合腎病雜志,2012,13(12)：1050-1052.

[6]張學敏,傅穎媛.MTS法在腫瘤藥敏試驗中的研究進展[J].江西醫學檢驗,2005,23(3)：252,285.

The impact of the muscovy duck reovirus on the muscovy duck embryo fibroblast activity by MTS method

Lin Zexin
（Pinghe county animal disease prevention and control center,Pinghe Fujian 363700）

The experiment adopts the MTS method to detect the effects of different pathogenicity of muscovy duck reovirus on muscovy duck embryo fibroblast viability after inoculation of 12 h,24 h,36 h,48 h,72 h,96 h.according to cell lesions and dynamic state to determine the inflection point,characteristic changes of inducing apoptosis and cell viability after muscovy duck reovirus infection,further understand the relationship between virus and host,and provide scientific basis for the infection and pathogenesis of muscovy duck reovirus.Results show that after inoculated 36 h,cell activity reached the highest level,MDEF infected by the high pathogenic YB strain,the cell activity decreased significantly in 48 h and showed obvious cell apoptosis,MDEF infected by The low pathogenic YJL strain,the cell apoptosis was apparent in 72 h.

The MTS test Muscovy duck reovirus Muscovy ducks embryo fibroblasts The cell vitality

A

1003-4331（2017）06-0013-04