應用熒光PCR診斷雞腺胃型傳染性支氣管炎

陳秀琴 黃梅清 蔡 羲 江 斌 陳少鶯 吳南洋＊

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所 福州 350013；2.福建省畜禽疫病防治工程技術研究中心 福州 350013）

應用熒光PCR診斷雞腺胃型傳染性支氣管炎

陳秀琴1,2黃梅清1,2蔡 羲1,2江 斌1,2陳少鶯1,2吳南洋1,2＊

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所 福州 350013；2.福建省畜禽疫病防治工程技術研究中心 福州 350013）

應用熒光PCR試劑盒對臨床表現(xiàn)為消瘦和腺胃腫大為特征的患雞病料進行雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒（REV）和雞馬立克氏病病毒（MDV）核酸檢測。結果顯示：雞傳染性支氣管炎病毒熒光RT-PCR檢測為陽性，禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒熒光RT-PCR檢測為陰性，雞馬立克氏病病毒熒光PCR檢測為陰性。結合患雞精神沉郁，極度消瘦，腺胃腫大如球狀等的臨床表現(xiàn)，綜合分析表明該患雞發(fā)病主要病因為感染雞腺胃型傳染性支氣管炎病毒。

傳染性支氣管炎 腺胃型 病原檢測

雞傳染性支氣管炎（IB）是由傳染性支氣管炎病毒 （IBV）引起的雞的一種急性、高度接觸性傳染病[1]。IBV非常容易通過突變和重組而產(chǎn)生新的血清型[2]。目前，至少已經(jīng)分離出二十多個血清型和變異株，主要包括呼吸道型、腎型、腸型和腺胃型等，我國主要以腎型傳染性支氣管炎為主[3-4]。1997年，王玉東首次報道引起腺胃病變的IBV變異株，并將其暫命名為腺胃型傳染性支氣管炎[5]。腺胃型傳染性支氣管炎已在全國范圍內(nèi)傳播，江蘇、山東、安徽、河南、河北等省區(qū)均有該病的報道。福建省農(nóng)業(yè)科學院畜禽水產(chǎn)疫病診療中心每年接診的家禽疾病中，確診為腺胃型傳染性支氣管炎的病例可達十多例。該病在臨床癥狀和病理變化與禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病和腺胃型馬立克氏病非常相似，需要進行實驗室檢測才能確診。感染該病的雞群病死率較高，可達30%～50%[6]，給養(yǎng)殖場帶來嚴重的經(jīng)濟損失。本項目組對福建省某養(yǎng)雞場送檢的病死雞進行病理觀察和實驗室病原檢測，結合臨床表現(xiàn)和流行病學情況，初步表明該病例是由腺胃型傳染性支氣管炎病毒引起的，現(xiàn)將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑 RNA提取試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；雞傳染性支氣管炎病毒熒光RTPCR檢測試劑盒購自北京生科尚儀科技有限公司；禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒（REV）核酸檢測試劑盒（RT-PCR熒光探針法）和雞馬立克氏病病毒（MDV）核酸擴增檢測試劑盒（PCR熒光探針法）購自廣州維伯鑫生物科技有限公司。

1.2 臨床癥狀與病理觀察 觀察患雞的精神狀態(tài)、羽毛、糞便及呼吸情況，檢查患雞的營養(yǎng)狀況、皮膚和爪。患雞解剖后檢查五臟、腸、氣囊、氣管和法氏囊是否發(fā)生病理變化。

1.3 病料處理 無菌采集病死雞腫大的腺胃、肺、肝等組織，按1∶5的比例加入無菌PBS勻漿后制成乳懸液，反復凍融3次，8 000 r/min離心15 min后收集上清液。

1.4 病原的熒光PCR檢測

1.4.1 核酸提取 吸取上清液200 μL到1.5 mLR-Nase-free的離心管，按照EasyPure Viral DNA/RNA Kit說明書提取樣品的核酸。核酸提取步驟按照EasyPure Viral DNA/RNA Kit說明書操作。

1.4.2 IBV熒光RT-PCR反應體系及條件 反應體系：RT-PCR 反應液 15 μL，RT-PCR 酶 0.25 μL，Taq酶0.25 μL，RNA溶液 10 μL。 擴增分 4步進行。 第1步：42℃ 30 min；第2步：92℃ 3 min；第3步：92 ℃ 10 s，45 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s （5個循環(huán)）；第4步：92℃ 10 s，60℃ 30 s(40個循環(huán))， 收集FAM熒光。

1.4.3 REV熒光RT-PCR反應體系及條件 反應體系：反應液 20 μL，酶液 1 μL，RNA 溶液 4 μL。 擴增分3步進行。第1步：42℃ 20 min；第2步：95℃10 min；第 3 步：94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s（40 個循環(huán)），收集FAM熒光。

1.4.4 MDV熒光PCR反應體系及條件 反應體系：反應液 20 μL，酶液 1 μL，DNA 溶液 4 μL。 擴增分2步進行。第1步：95℃ 10 min；第2步：94℃15 s，55 ℃ 30 s（40 個循環(huán)），收集 FAM 熒光。

2 結果與分析

2.1 臨床癥狀與病理變化 患雞精神沉郁，呼吸有啰音，羽毛松亂，腳干脫水，體型極其消瘦（見圖1），發(fā)育不良，排黃色、白色稀糞，或水樣腹瀉，泄殖腔口附近的羽毛有糞便粘住。

剖檢患雞可見氣管環(huán)出血，氣囊渾濁，腺胃極度腫脹，腫大如球狀（見圖2），腺胃壁增厚，肌胃癟縮，其他器官無明顯眼觀可見病理變化。

圖1 患雞極度消瘦

2.2 病原的熒光PCR檢測 應用IBV熒光RTPCR檢測試劑盒檢測IBV，擴增曲線見圖3。陽性對照、陰性對照和樣品的CT值分別為21.3、none、14.0，因此，判定樣品為IBV陽性。

應用REV熒光RT-PCR檢測試劑盒檢測REV，擴增曲線見圖4。陽性對照、陰性對照和樣品的 CT值分別為 19.5、none、none，因此，判定樣品為REV陰性。

圖2 患雞腺胃腫大如球狀

應用MDV熒光PCR檢測試劑盒檢測MDV，擴增曲線見圖5。陽性對照、陰性對照和樣品的CT值分別為24.6、39.5、none，因此，判定樣品為MDV 陰性。

圖3 IBV熒光RT-PCR擴增曲線

圖4 REV熒光RT-PCR擴增曲線

3 結論與討論

應用熒光PCR試劑盒對病死雞進行IBV、REV和MDV病原檢測，檢測結果為IBV陽性，REV和MDV均為陰性，結合臨床癥狀和病理剖檢變化，初步診斷該起病例為腺胃型傳染性支氣管炎。

圖5 MDV熒光PCR擴增曲線

IB不僅直接影響雞的生產(chǎn)性能，還會導致免疫機能下降，繼發(fā)感染其他疾病，發(fā)病率和病死率都很高，已被世界衛(wèi)生組織列為B類疫病。該病無明顯的發(fā)病季節(jié)，各年齡和品種的雞都易感，雛雞發(fā)病率可達75%～90%[7]。IB主要是通過空氣和排泄物接觸傳播，病程為15~35 d，甚至可長達2個月[8]。目前，IBV已經(jīng)有呼吸道型、腎型、腸型和腺胃型等多種血清型，不同血清型之間不存在交叉反應或交叉反應很小[4]。近十年來，雞傳染性支氣管炎病毒LX4型QX分離株的比例不斷增加，而常用疫苗株M41基因型分離株的比例卻不斷減少[9]，因此，現(xiàn)有的疫苗對雞傳染性支氣管炎的保護效果不好。許多研究者也開始研發(fā)新型疫苗，如重組載體DNA疫苗、質(zhì)粒DNA疫苗等[10]。目前還沒有治療IB的特效藥，臨床上一般使用抗病毒中藥來緩解癥狀，無治療價值的雞一般予以淘汰。預防控制IB的主要措施是疫苗接種，進行免疫監(jiān)測，加強平時的飼養(yǎng)管理等。

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[4]劉勝旺.我國雞傳染性支氣管炎流行現(xiàn)狀及原因分析[J].中國家禽,2010,32(16)：5-9.

[5]王玉東,張子春,王永玲,等.雞腺胃型傳染性支氣管炎研究初報[J].中國動物檢疫,1997,14(3)：6-8.

[6]張淑霞,楊增岐,賀秀媛,等.雞腺胃型傳染性支氣管炎病毒的分離與初步鑒定[J].動物醫(yī)學進展,2006,27(12)：79-81.

[7]閆藝婷,勾肖晶,劉靜,等.傳染性支氣管炎病毒的分子生物學特性及其弱毒疫苗的研究進展 [J].中國畜牧獸醫(yī),2015,42(6)：1587-1591.

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[9]張國中,趙燁,程晉龍,等.1994-2014年禽傳染性支氣管炎病毒流行演化趨勢分析 [C]//第四屆全國禽病分子生物技術青年工作者會議論文集.天津,2015.

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Diagnosis proventriculus type infections bronchitis by applying real-time fluorescent quantitative PCR

Chen Xiuqin1,2Huang Meiqing1,2Cai Xi1,2Jiang Bin1,2Chen Shaoying1,2Wu Nanyang1,2*
(1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Fujian Academy of Agricultural Science,Fuzhou 350013；2.Fujian Animal Diseases Control Technology Development Center,Fuzhou 350013)

The study detected the nucleic acid of diseased chickens with clinical symptoms of emaciation and swollen proventriculus by using fluorescent PCR kit.The detection including infections bronchitis virus(IBV),Reticuloendotheliosis virus(REV)and Marek's Disease(MDV).The results showed that IBV was positive but REV and MDV were negative.Combing the clinical symptoms of acting depressed,extreme emaciation and swollen proventriculus,thus,it was concluded that the diseased chickens were infected with IBV.

Infections bronchitis Proventriculus type Pathogen detection

A

1003-4331（2017）06-0010-03

福建省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)雞產(chǎn)業(yè)技術體系（2013-2017年）資助。

陳秀琴（1988-），女，碩士。研究方向：預防獸醫(yī)學。E-mail：lyunxqchen@163.com。 并列第一作者：黃梅清(1980-)，女，碩士，助理研究員。研究方向：預防獸醫(yī)學。

＊通信作者：吳南洋（1963-），男，高級獸醫(yī)師。主要從事獸醫(yī)臨床和健康養(yǎng)殖技術研究。E-mail：wunanyang@vip.sina.com。