三七總皂甙對大黃魚腎細胞生長及部分免疫相關基因表達的影響

陳秀霞 鄭在予 黃 河 池洪樹 龔 暉

福建省農業科學院生物技術研究所 福州 350003

三七總皂甙對大黃魚腎細胞生長及部分免疫相關基因表達的影響

陳秀霞 鄭在予 黃 河 池洪樹 龔 暉＊

福建省農業科學院生物技術研究所 福州 350003

本試驗將三七總皂甙（PNS）體外作用于大黃魚腎細胞，通過活細胞計數和熒光定量PCR檢測，初步了解PNS對大黃魚腎細胞生長及部分免疫相關因子表達的影響。結果顯示，40～200 μg/mL濃度的PNS對大黃魚腎細胞生長無明顯影響，但濃度達到1 mg/mL以上時，對細胞生長有負面影響；10～1 000 μg/mL濃度的 PNS對大黃魚腎細胞Toll樣受體5 mRNA的表達有一定的上調作用，但對Toll樣受體3的表達有一定的下調作用；PNS濃度為10～100 μg/mL時對大黃魚腎細胞堿性磷酸酶的表達無明顯影響，但濃度達到1 000 μg/mL時對該因子的表達有下調作用；PNS濃度為10 μg/mL時對大黃魚腎細胞溶菌酶的表達無明顯影響，但濃度達到100 μg/mL以上時對該因子的表達具有一定的下調作用。

三七總皂甙 大黃魚 腎細胞 Toll樣受體 堿性磷酸酶 溶菌酶

三七總皂甙 （Panax notoginseng saponins，PNS）為植物三七提取的有效活性成分，其主要成分為人參皂甙R b1、人參皂甙R g1、三七皂甙R1等，具有廣泛的藥理作用，其中包括免疫調節作用[1-2]。目前研究較多的是PNS對哺乳動物的免疫調節作用，有關PNS對魚類免疫調節作用的研究報道較少，尚未見PNS對魚類體外細胞免疫相關因子表達影響的相關研究報道。本試驗將PNS體外作用于大黃魚腎細胞，通過活細胞計數和部分相關免疫因子表達量的檢測，初步了解PNS對大黃魚腎細胞的毒性及免疫因子表達的調節作用。

1 材料與方法

1.1 細胞來源 試驗所采用的第47代大黃魚腎細胞系（YCK）由本實驗室建系并保藏。

1.2 主要儀器 高速冷凍離心機（Sigma），紫外分光光度計 （Beckman）；CFX384多重實時熒光定量PCR 儀（Bio-Rad）；生化培養箱（上海博迅）。

1.3 主要試劑 三七總皂甙（PNS）購自南京澤朗醫藥科技有限公司，含量為95%。L-15細胞培養液為Hyclone公司產品，胎牛血清為Gibico公司產品，臺盼藍（Sigma 產品）以 0.01 M PBS（pH7.4）配制成 4%母液，4℃保存，使用時用 0.01 M PBS（pH7.4）稀釋成0.4%工作液。RNA提取試劑盒為TRIzol?Plus RNA Purification Kit（Invitrogen公司產品）和RNase-Free DNase Set（Qiagen公司產品）；逆轉錄（RT-PCR）試劑盒為 SuperScriptTMIII First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR （Invitrogen公司產品）；Real time RT-PCR檢測使用的試劑盒為Power SYBR?Green PCR Master Mix（Applied Biosystems公司產品）。引物為上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 PNS對細胞的毒性

1.4.1 YCK細胞24孔培養 將YCK細胞接種于24孔培養板，采用含10%胎牛血清的L-15培養液培養， 每孔 500 μL，細胞濃度為 1×105個/mL，于生化培養箱27℃培養24 h后，吸棄培養液，進行給藥試驗，給藥孔處理如下：給藥孔分別加入500 μL含不同濃度梯度的PNS，含10%胎牛血清的L-15培養液，得到 5 mg/mL、1 mg/mL、200 ug/mL、40 ug/mL、8 ug/mL、1.6 ug/mL、0.32 ug/mL 共 7個濃度組；正常空白對照孔加500 μL含10%胎牛血清的L-15培養液；各組設三個平行，于27℃生化培養箱繼續培養24 h。

1.4.2 PNS對細胞的毒性試驗 取出培養板，各孔上清液吸入對應編號試管中，細胞層用0.35%胰酶消化，用新生小牛血清2滴終止反應，每孔加L-15細胞培養液1 mL，收集細胞懸液于對應上清液試管中，800 r/min離心5 min，吸棄上清液，留0.3～0.5 mL，輕輕吸吹為細胞懸液，取細胞懸液9滴移入尖底試管中，加1滴0.4%臺盼藍溶液混勻，用血球計數板計數拒染的活細胞數。

1.5 Real time RT-PCR檢測部分細胞因子mRNA的表達

1.5.1 YCK細胞在細胞瓶中培養 將YCK細胞接種于50 mL的細胞培養瓶，每瓶加入含10%胎牛血清的L-15培養液10 mL，于生化培養箱27℃培養至細胞長成單層后，每瓶分別加入PNS，使終濃度分別為 10 μg/mL、100 μg/mL 和 1 000 μg/mL， 每個濃度均設三個平行，同時設未加PNS的對照組。于27℃生化培養箱繼續培養24 h。

1.5.2 Real time RT-PCR模板制備 用細胞刮刀刮取細胞，重懸于5 mL無血清的L-15細胞培養液中，800 r/min離心5 min，吸棄上清液，用PBS洗滌沉淀后加1 mL Trizol，吹打裂解細胞5 min，移至EP管。總RNA提取步驟參照試劑盒說明書操作。按照逆轉錄反應試劑盒操作說明配制反應體系，反應條件為 25 ℃，10 min；50 ℃，30 min；85 ℃，5 min，貯存在-20℃備用。

1.5.3 Real time RT-PCR引物合成 細胞因子Toll樣受體 3（TLR3）、Toll樣受體 5（TLR5）、堿性磷酸酶（ALP）和溶菌酶（LZM）的引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5.4 Real time RT-PCR 按照試劑盒說明配制PCR反應體系，反應條件：95℃，1 min；40個循環（95 ℃，15 s；63 ℃，25 s，收集熒光）。 熔點曲線包括95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，15 s；60 ℃，15 s。 為校正組間加樣誤差，以內參β-Actin的CT值對樣本拷貝數加以校正，利用2-ΔΔCT方法計算出待測基因的相對表達量，其中CT是PCR產物熒光達到檢測閾值的擴增循環數。每個樣本設3個重復孔。

2 結果與分析

2.1 三七總皂甙對細胞的毒性 圖1示大黃魚腎細胞在不同濃度PNS作用下的生長情況。隨PNS濃度的變化（0.32 μg/mL～5 mg/mL），大黃魚 YCK 活細胞數呈正態分布。當PNS的濃度達到1 mg/mL以上時，對細胞生長有負面影響。

圖1 大黃魚腎細胞在不同濃度三七總皂甙作用下的生長情況

圖2 大黃魚腎細胞部分因子在三七總皂甙作用下的相對表達量

2.2 三七總皂甙對大黃魚腎細胞部分細胞因子表達的影響 圖2 （a、b、c、d） 示大黃魚腎細胞因子TLR3、TLR5、ALP和 LZM 在不同濃度 PNS作用下的相對表達量。

從圖 2（a）中可見，10 μg/mL 的 PNS 對 TLR3 的表達無明顯影響，但100 μg/mL和1 000 μg/mL的PNS對TLR3的表達具有下調作用，且下調作用與皂甙濃度呈正相關。

從圖2（b）中可以看出，各濃度皂甙組TLR5的表達量均高于對照組，且隨PNS濃度加大，TLR5的表達量越高。當PNS濃度為1 000 μg/mL時，TLR5的表達量是對照組的2.5倍。這表明PNS對大黃魚腎細胞因子TLR5的表達具有上調作用。

從圖 2（c）可以看出，10 μg/mL 和 100 μg/mL 皂甙組ALP的表達量與對照組無明顯差別；當皂甙濃度提高到1 000 μg/mL時，ALP的表達量低于對照組。這表明低濃度PNS對ALP的表達無明顯影響，高濃度PNS對ALP的表達具有下調作用。

從圖 2（d）可以看出，10 μg/mL 皂甙組 LZM 的表達量與對照組無明顯差別；當皂甙濃度為100 μg/mL 和 1 000 μg/mL 時，LZM 的表達量明顯低于對照組。這表明一定濃度的PNS對LZM的表達具有下調作用。

3 討 論

PNS對YCK細胞毒性試驗的初步結果顯示，YCK細胞的活細胞數與PNS濃度之間的關系并非呈線性關系，而是呈正態分布。PNS具有促進骨髓基質細胞向成骨細胞增殖、分化的作用[3]。本研究也表明，當PNS濃度為200 μg/mL時，對YCK細胞具有一定的促進增殖作用，但隨著PNS濃度升高，YCK活細胞數明顯下降，說明高濃度的PNS對YCK細胞增殖具有抑制作用。

Toll樣受體是一類Ⅰ型跨膜糖蛋白模式識別受體，其通過識別病原體，激活天然免疫，可誘導產生多種細胞因子，在抗感染免疫中發揮重要作用[4]。迄今在魚類中已發現多種Toll樣受體。Toll樣受體3同時存在于哺乳動物和魚類，位于細胞質核內體上，參與雙鏈RNA的識別，是抗病毒免疫反應和免疫機制進化研究的理想對象[5]。Toll樣受體5是機體免疫系統識別鞭毛蛋白的受體，介導機體針對鞭毛蛋白產生的免疫反應和炎癥反應[6]。本試驗初步結果表明，PNS對YCK細胞TLR3的表達有一定的下調作用，而在PNS作用下，TLR5的表達上調，是否意味著TLR5是PNS的主要受體？其機理還有待進一步研究探討。

堿性磷酸酶在魚體內是一種參與代謝調控的非特異性磷酸水解酶，參與鈣磷代謝，與機體的免疫密切相關[7]。溶菌酶作為魚類的非特異性免疫物質之一，在魚體抵抗感染性致病菌的最前沿防御機制中起著重要作用[8]。本試驗結果顯示，低劑量的PNS對大黃魚腎細胞的堿性磷酸酶和溶菌酶的表達沒有明顯影響，但當PNS的濃度達到1 mg/mL時，對這兩種酶的表達有一定的下調作用。據報道，飼料中添加適量的PNS可顯著提高羅非魚血清溶菌酶和堿性磷酸酶的活性[9]，該報道結果與本研究的試驗結果不一致，這可能與二者的試驗對象、方法、采樣部位及PNS劑量不同有關。目前尚未見其他有關PNS對魚類體外細胞溶菌酶和堿性磷酸酶mRNA表達影響的研究報道。

4 結 論

高濃度的PNS對大黃魚腎細胞的生長有負面影響。PNS對大黃魚腎細胞的Toll樣受體TLR3的mRNA的表達有一定的抑制作用，但對Toll樣受體TLR5的表達有一定的促進作用。低濃度的PNS對大黃魚腎細胞堿性磷酸酶和溶菌酶的表達無明顯影響，但高濃度的PNS對該因子的表達具有一定的抑制作用。

[1]劉劍娜,朱靖博,閏海全,等.三七總皂苷中Rg1和Rbl的分離純化[J].大連工業大學學報,2010,29(1)：18-20.

[2]張喜平,齊麗麗,劉達人.三七及其有效成分的藥理作用研究現狀[J].醫學研究雜志,2007,36(4)：96-98.

[3]劉東寧,王云國,劉志禮,等.三七總皂甙對大鼠骨髓基質細胞骨形成蛋白-2表達及堿性磷酸酶活性的影響[J].南昌大學學報（醫學版）,2012,52(9)：9-13.

[4]吳迪,劉玉芬,唐敬潔.Toll樣受體及其與細菌感染性疾病關系的研究進展[J].中國家禽,2016,38(17)：50-52.

[5]ROACH J C,GLUSMAN G,ROWEN L,et al.The evolution of vertebrate Toll-like receptors[J].Proc Nati Acad Sci USA,2005,102(27)：9577-9582.

[6]楊昱,徐劍鋮,錢桂生,等.Toll樣受體5在鞭毛蛋白致大鼠急性肺損傷中的表達及其研究 [J].中華肺部疾病雜志,2007,1(1)：52-55.

[7]羅克.動物粘膜免疫系統研究進展 [J].福建畜牧獸醫,2000,22(5)：44-49.

[8]王建超,張培軍,張東鳴,等.不用組合芽孢桿菌對鯉魚免疫功能的影響[J].中國獸醫雜志,2016,52(2)：110-113.

[9]楊志剛,忻晨,闕有清,等.三七總皂苷對羅非魚體成分及非特異免疫的影響[J].飼料工業,2010,31(14)：10-12.

The effects of Panax notoginseng saponins on the growth and the immune related genes expression of large yellow croaker kidney cells

Chen Xiuxia Zheng Zaiyu Huang He Chi Hongshu Gong Hui*
(Biotechnology Institute,Fujian Academy of Agricultural Sciences Fuzhou 350003)

In this study,large yellow croaker kidney cells （YCK)were exposed to Panax notoginseng saponins （PNS)in vitro.To evaluate the effect of PNS on the growth and the immune related genes expression of YCK,living cells count and real time RT-PCR were performed.The results showed that PNS with the concentration of 40～200 μg/mL had no obvious effect on the growth of YCK,but when the concentration reached 1 mg/mL,it had a negative effect on cell growth.PNS with the concentration of 10～1 000 μg/mL upregulated the expression of the toll-like receptor 5 mRNA of YCK,but it down-regulated the expression of the toll-like receptor 3.PNS with the concentration of 10～100 μg/mL had no influence on the expression of alkaline phosphatase of YCK,but the expression of the factor was down-regulated when the concentration of PNS reached 1 000 μg/mL.PNS with the concentration of 10 μg/mL had no obvious influence on the expression of lysozyme in YCK,but it reduced the expression of this factor when the concentration reached 100 μg/mL.

Panax notoginseng saponins （PNS)Large yellow croaker（Pseudosciaena crocea)Kidney cells Toll-like receptor Alkaline phosphatase Lysozyme

A

1003-4331（2017）06-0007-04

福建省自然科學基金（2015J01106）、大黃魚育種國家重點實驗室開放課題基金資助。

陳秀霞 （1977-）， 副研究員。E-mail：xiuxiachen@163.com。

＊ 通信作者：龔暉（1971-），研究員。 E-mail：ghxfjm@163.com。