非小細胞肺癌患者血清中miRNA-449a的表達及其臨床意義

張笑添，劉利紅(山西醫科大學汾陽學院生物化學教研室,汾陽 0300;山西省汾陽醫院呼吸內科;通訊作者,E-mail:604864@qq.com)

非小細胞肺癌患者血清中miRNA-449a的表達及其臨床意義

張笑添1*，劉利紅2
(1山西醫科大學汾陽學院生物化學教研室,汾陽 032200;2山西省汾陽醫院呼吸內科;*通訊作者,E-mail:116048164@qq.com)

目的 探討miRNA-449a在非小細胞肺癌患者血清中的表達及其臨床應用價值。 方法 采用熒光定量PCR法檢測26例非小細胞肺癌患者和30例健康人群血清中miRNA-449a的表達含量,分析血清miRNA-449a的含量與非小細胞肺癌患者臨床病理特征的關系,并通過受試者工作曲線(ROC)分析miRNA-449a在非小細胞肺癌診斷中的特異性和敏感性。 結果 非小細胞肺癌患者血清中miRNA-449a的含量顯著低于健康人群(P<0.05);非小細胞肺癌血清中miRNA-449a的表達與腫瘤TNM分期以及淋巴結轉移有相關性(P<0.05),與病理組織學類型無相關性(P>0.05)。ROC曲線下面積(AUC)為0.840(95%CI 0.693-0.986),取0.624作為其臨界值時,其敏感性和特異性分別為77.8%和84.6%。 結論 miRNA-449a在非小細胞肺癌血清中低表達,并可能成為非小細胞肺癌患者診斷的腫瘤標志物之一。

非小細胞肺癌; miRNA-449a; ROC曲線

肺癌作為全球發病率較高的惡性腫瘤之一,其死亡率居于榜首[1]。絕大多數肺癌患者在就診時已經屬于中晚期,其最低的生存期僅有15%[2],因此肺癌的早期診斷就顯得尤為重要。miRNA作為一種非編碼RNA,可以通過結合靶基因的3′UTR區以轉錄后調控的方式調節基因的表達,進而發揮著多種生物學功能。近幾年研究表明,miRNA的表達與腫瘤的發生發展密切相關,同時在血清中可以長期穩定存在,因此有可能作為一種早期的腫瘤標志物應用于臨床[3]。已有研究發現miRNA-449a在非小細胞肺癌患者組織中的表達明顯降低[4,5],但是miRNA-449a在非小細胞肺癌患者血清中表達的相關研究則尚未報道。因此在本研究中,通過熒光定量PCR檢測miRNA-449a在非小細胞肺癌患者血清中的表達,探討miRNA-449a在非小細胞肺癌中的診斷價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

血清標本來自于2016-08～2017-04山西省汾陽醫院呼吸內科收治的非小細胞肺癌患者26例,其中男14例,女12例,年齡范圍為45-78歲,病理類型包括腺癌10例,鱗癌16例,TNM分期則根據國際肺癌研究會(IASLC)公布的分期原則,其中Ⅰ-Ⅱ期9例,Ⅲ-Ⅳ期17例,所有患者經過病理活檢確診且未進行抗腫瘤治療。同時選取體檢中心的健康人群30例,其中男14例,女16例作為對照組,年齡范圍為40-69歲,經檢查無肝、腦等臟器疾病,無消化道以及血液病史。本研究經過本院倫理委員會批準,均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

miRcute血清miRNA提取分離試劑盒、miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRcute miRNA熒光定量PCR試劑盒、miRNA-449a引物以及外參均購于北京天根生化科技有限公司。

1.3 方法

1.3.4 熒光定量PCR檢測血清中miRNA-449a的表達 熒光定量PCR的反應體系為20 μl,其中2×miRNA Plus miRNA Premix 10 μl,上下游引物各0.5 μl,cDNA產物2 μl,其余用水補齊。反應條件為:95 ℃預變性15 min;94 ℃ 20 s,60 ℃ 34 s,40個循環,后續進行熔解曲線分析,所有樣本均做3個復孔,miRNA-449a的相對表達量采用2-ΔΔCt表示。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 miRNA-449a的表達水平

熒光定量PCR結果顯示非小細胞肺癌患者血清中的miRNA-449a的表達量為0.82±0.55,顯著低于健康對照組的2.08±1.20,差異具有統計學意義(P<0.05,見圖1)。

與健康對照組相比,*P<0.05圖1 非小細胞肺癌和健康對照組血清中miRNA-449a的表達水平Figure 1 The expression of miRNA-449a in non-small cell lung cancer and healthy controls

2.2 非小細胞肺癌患者血清miRNA-449a的含量與臨床病理參數之間的關系

非小細胞肺癌患者血清中的miRNA-449a表達在TNM分期Ⅲ-Ⅳ的水平顯著低于TNM分期Ⅰ-Ⅱ(P<0.05),淋巴結有轉移患者其表達顯著低于無轉移患者(P<0.05),但miRNA-449a的水平與不同性別、不同年齡以及不同組織學類型等臨床病理參數之間差異無統計學意義(P>0.05,見表1)。

2.3 ROC曲線分析診斷效率

通過檢測非小細胞肺癌患者和健康對照組血清中miRNA-449a的水平建立ROC曲線,miRNA-449a ROC曲線下面積(AUC)為0.840(95%CI 0.693-0.986),miRNA-449a取0.624為其臨界值時,其敏感性和特異性分別為77.8%和84.6%(見圖2)。

3 討論

近幾年來,miRNA已經逐漸成為了研究的熱點,外周血循環中的miRNA由于具備有一定的組織特異性以及穩定性[6],更多的作為腫瘤標志物之一[7],用來監測腫瘤的發生和發展。miRNA-449a在胃癌[8]、膀胱癌[9]等的表達下調,有研究報道,miRNA-449a在肺癌[4,5,10]中的表達也是下調的,同時研究發現miRNA-449a可以靶向調控c-Met[4]、E2F3[11]、E2F1[12]等基因進而調控肺癌細胞增殖和遷移,這些研究提示miRNA-449a參與了非小細胞肺癌的形成與發展,可能是一個潛在的診斷分子標志物。也有研究[13]發現，非小細胞肺癌患者血清中的miRNA-449a的水平下降,但是miRNA-449a在非小細胞肺癌中的診斷價值則尚未報道。

臨床病理參數nmiRNA?449a的表達量tP性別0 013>0 05 男141 537±0 24 女121 538±0 22年齡0 522>0 05 ≤60歲61 82±0 69 >60歲201 66±0 58吸煙史0 776>0 05 無111 62±0 52 有151 81±0 61組織學類型0 081>0 05 鱗癌161 76±0 42 腺癌101 74±0 48TNM分期4 574<0 05 Ⅰ-Ⅱ91 53±0 23 Ⅲ-Ⅳ170 95±0 35淋巴結轉移6 144<0 05 有110 93±0 31 無151 71±0 32

圖2 非小細胞肺癌患者血清miRNA-449a的ROC曲線Figure 2 The ROC curve of serum miRNA-449a in non-small cell lung cancer

本研究中,通過熒光定量PCR檢測非小細胞肺癌患者血清中miRNA-449a的表達,結果發現miRNA-449a在非小細胞肺癌患者的水平顯著低于健康對照組,同時進一步分析miRNA-449a與臨床病理參數之間的關系,發現TNMⅢ-Ⅳ期的患者miRNA-449a的水平低于TNMⅠ-Ⅱ期的,淋巴結轉移的患者miRNA-449a的水平也低于淋巴結未轉移的,此結果說明miRNA-449a在非小細胞肺癌的發生和發展中可能起到了抑癌基因的作用,其水平與淋巴轉移以及TNM分期密切相關。而ROC曲線結果顯示其曲線下面積(AUC)為0.840,敏感性和特異性分別為77.8%和84.6%,此結果提示miRNA-449a有可能作為一種新型分子標志物用于小細胞肺癌的診斷。

綜上所述,miRNA-449a在非小細胞肺癌血清中表達顯著降低,并有可能作為一種腫瘤標志物之一,但是由于研究的樣本數量較少,其臨床價值還有待于擴大樣本數量進一步驗證。

[1] Mellema WW,Burgers SA,Smit EF.Tumor flare after start of RAF inhibition in KRAS mutated NSCLC: a case report[J].Lung Cancer,2015,2(87):201-203.

[2] Vander Drift MA,Karim-Kos HE,Siesling S,etal. Progress in standard of care therapy and modest survival benefits in the treatment of non-small cell lung cancer patients in the Netherlands in the last 20 years[J].J Thorac Oncol,2017,7(2):291-298.

[3] Chin LJ,Slack FJ.A truth serum for cancer-microRNAs have major protential as cancer biomarkers[J].Cell Res,2008,18(10):983-984.

[4] Luo WT,Huang B,Li ZX,etal. MicroRNA-449a is downregulated in non-small cell lung cancer and inhibits migration and invasion by targeting c-Met[J].PLoS one,2013,8(5):1-11.

[5] Jeon HS,Lee SY,Lee EJ,etal.Combining microRNA-449a/b with a HDAC inhibitor has a synergistic effect on growth arrest in lung cancer[J].Lung Cancer,76(2):171-176.

[6] Chen X,Ba Y,Ma L,etal.Characterization of microRNAs in serum:a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases[J].Cell Res,2008,18(10):997-1006.

[7] Shen J,Todd NW,Zhang H,etal.Plasma microRNAs as potential biomarkers for non small cell lung cancer[J].Lab Invest,2011,91(4):579-587.

[8] Bou Kheir T, Futoma-Kazmierczak E, Jacobsen A,etal. MiR-449 inhibits cell proliferation and is down-regulated in gastric cancer[J], Mol Cancer,2011, 10(1): 1-12.

[9] Chen H, Lin YW, Mao YQ,etal. MicroRNA-449a acts as a tumor suppressor in human bladder cancer through the regulation of pocket proteins[J]. Cancer Lett,2012, 320(1): 40-47.

[10] 林劍勇,鄧益斌,羅艷紅,等.miRNA-449a在人肺癌及癌旁組織中的差異[J].基礎醫學與臨床,2015,35(1):44-47.

[11] Ren XS,Yin MH,Zhang X,etal.Tumor-suppressive microRNA-449a induces growth arrest and senescence by targeting E2F3 in human lung cancer cell[J].Cancer Lett,2014,344(2):195-203.

[12] Yang X,Feng M,Jiang X,etal. MiR-449a and miR-449b are direct transcriptional targets of E2F1 and negatively regulate pRb—E2F1 activity through a feedback loop by targeting CDK6 and CDC25A[J].Gene Dev,2009,23(20):2388-2393.

[13] Ding M,Qiu TF,Zhou PG. MicroRNA-449a suppresses non-small cell lung cancer[J].Cell Biochem Biophys,2015,71(2):1255-1259.

ExpressionofmiRNA-449ainserumanditsclinicalsignificanceinpatientswithnon-smallcelllungcancer

ZHANG Xiaotian1*,LIU Lihong2
(1DepartmentofMedicalLaboratoryScience,FenyangCollegeofShanxiMedicalUniversity,Fenyang032200,China;2FenyangHospitalofShanxiProvince;*Correspondingauthor,E-mail:116048164@qq.com)

ObjectiveTo investigate the expression of miRNA-449a in serum of patients with non-small cell lung cancer and its clinical significance.MethodsThe quantitative real-time PCR was used to detect the expression of miRNA-449a in 26 non-small cell lung cancer patients and 30 healthy controls. The relationship between the serum of serum miRNA-449a and clinical pathological parameters was analyzed. The specificity and sensitivity of miRNA-449a in the diagnosis of non-small cell lung cancer was determined by receiver-operating characteristic(ROC) curves.ResultsThe expression of miRNA-449a in non-small cell lung cancer was significantly lower than that of healthy controls(P<0.05). The expression of miRNA-449a was significantly associated with the tumor clinical stage(TNM) and lymphatic metastasis(P<0.05), and the expression of miRNA-449a was not significantly associated with the histological type(P>0.05).The area under ROC was 0.840(95%CI 0.693-0.986), and the sensitivity and specificity were 77.8% and 84.6% when 0.513 was selected as the critical value.ConclusionThe expression of serum miRNA-449a is significantly reduced in patients with non-small cell lung cancer cell, and it may be a biomarker for the clinical diagnosis of non-small cell lung cancer.

non-small cell lung cancer; miRNA-449a; ROC curve

山西醫科大學汾陽學院科研項目(2017B05)

張笑添,女,1982-05生,碩士,講師,E-mail:116048164@qq.com

2017-09-11

R734.2

A

1007-6611(2017)12-1273-03

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.12.015