miR-655-3p對胃癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

原姍姍,張彥亭,張 欣,左利平,莊 坤,唐海靈(西安交通大學附屬西安市中心醫院消化內科,西安 710003;通訊作者,E-mail:xasthl@163.com)

miR-655-3p對胃癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

原姍姍,張彥亭,張 欣,左利平,莊 坤,唐海靈*
(西安交通大學附屬西安市中心醫院消化內科,西安 710003;*通訊作者,E-mail:xasthl@163.com)

目的 探討miR-655-3p對胃癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響。 方法 采用qRT-PCR檢測miR-655-3p在GES-1、MKN-28、SGC-7901和BGC-823細胞系中的表達水平;qRT-PCR證實轉染agomiR-655-3p后miR-655-3p的過表達水平;MTT實驗檢測過表達miR-655-3p對胃癌細胞增殖的影響;Transwell實驗檢測過表達miR-655-3p對胃癌細胞遷移和侵襲能力的影響。 結果 與GES-1細胞相比,miR-655-3p在MKN-28、SGC-7901和BGC-823細胞系中的表達均降低(P<0.05),其中低分化的BGC-823細胞系表達最低;轉染agomiR-655-3p將BGC-823細胞中成熟miR-655-3p的表達水平提高了35.3倍(P<0.05);過表達miR-655-3p可抑制BGC-823細胞增殖(P<0.05);過表達miR-655-3p降低了BGC-823細胞的遷移和侵襲能力,每個視野遷移細胞數由223±15降低至117±9(P<0.05),侵襲細胞數由124±14降低至61±6(P<0.05)。 結論 過表達miR-655-3p可抑制BGC-823胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲。

胃癌; miR-655-3p; 細胞增殖; 細胞遷移; 細胞侵襲

胃癌是全球第四大最常見的惡性腫瘤,其分布具有明顯的地域特征,中國、日本、韓國等東亞國家屬于胃癌高發國家。胃癌的病因包括幽門螺桿菌感染、飲食習慣、遺傳因素等。國際癌癥研究機構(IARC)統計數據表明,2008年全球胃癌新發病例98.9萬,占所有癌癥新發病例的7.8%,僅次于肺癌、乳腺癌、結直腸癌[1]。

微小RNA(microRNA,miRNA)屬于單鏈非編碼RNA分子,長度僅為18-24個核苷酸,能夠和特定mRNA的3′端非翻譯區結合,導致mRNA的降解或蛋白翻譯受阻,從而抑制基因表達。一個miRNA分子可調控多個mRNA的表達,而一個mRNA也可受多個miRNA分子的調控,從而形成了復雜的調控網絡。miRNA廣泛參與了多種細胞生物學過程,如細胞增殖、細胞凋亡、細胞分化等。大量研究證實,miRNA既可以作為抑癌基因,又可以作為癌基因,其異常表達與腫瘤的形成和發展密切相關[2]。已有研究表明miR-655-3p具有抑制腫瘤的作用,但尚未有其與胃癌相關性的研究報道[3]。本研究旨在初步探討miR-655-3p對胃癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響。

1 材料和方法

1.1 主要儀器

CO2細胞培養箱(Thermo,美國);超凈工作臺(蘇州真田潔凈有限公司);正置熒光顯微鏡(Olympus,日本);臺式低溫離心機(Eppendorf,德國);NanoDrop ND-1000分光光度計(NanoDrop Tech,美國);ABI 7500 Fast實時定量PCR儀(Applied Biosystems,美國);iMark酶標儀(Bio-Rad,美國)。

1.2 主要試劑

DMEM高糖細胞培養基(上海聯碩生物科技有限公司);胎牛血清(上海玉博生物科技有限公司);TRIzol、Lipofectamine 2000脂質體(Invitrogen,美國);SYBR Premix Ex Taq聚合酶、One Step PrimeScript?miRNA cDNA合成試劑盒(TaKaRa,日本);MTT細胞增殖檢測試劑盒、結晶紫染色液(上海碧云天生物技術有限公司);Matrigel基質膠(BD Bioscience,美國)。

1.3 細胞培養

人永生化胃黏膜上皮細胞系GES-1及3種人胃癌細胞系MKN-28(高度分化)、SGC-7901(中度分化)、BGC-823(低度分化)均由西安市中心醫院消化內科保存。采用含10%胎牛血清的DMEM于CO2細胞培養箱中常規培養,待細胞生長至對數生長期,胰酶消化,收集細胞用于實驗。

1.4 RNA提取及實時定量PCR(qRT-PCR)

TRIzol法提取總RNA,用ND-1000分光光度計進行核酸定量,采用One Step PrimeScript?miRNA cDNA合成試劑盒進行逆轉錄反應,以SYBR Premix Ex Taq聚合酶進行qRT-PCR,反應條件為:95 ℃ 30 s預變性,95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s兩步法進行40個循環。miR-655-3p的上游引物為5′-CCG CGA TAA TAC ATG GTT AAC CTC-3′,下游引物為Uni-miR qPCR通用引物,內參U6上游引物為5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′,下游引物為5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′[4]。

1.5 寡核苷酸細胞轉染

miR-655-3p激動劑(agomiR-655-3p)和陰性對照(negative control,NC)購自上海吉瑪制藥技術有限公司,agomiR-655-3p正義鏈序列為5′-AUA AUA CAU GGU UAA CCU CUU U-3′,反義鏈序列為5′-AGA GGU UAA CCA UGU AUU AUU U-3′,陰性對照正義鏈序列為5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′,反義鏈序列為5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3′。應用Lipofectamine 2000脂質體進行寡核苷酸細胞轉染,具體步驟按說明書操作。

1.6 MTT實驗檢測細胞增殖

收集寡核苷酸轉染后的細胞,以2×103個細胞/孔的密度接種96孔板,分別在培養0,1,2,3,4 d時,向培養孔中加入MTT溶液,繼續培養4 h,棄上清后每孔加入150 μl的DMSO以溶解甲臜顆粒,應用iMark酶標儀檢測490 nm處的吸光度(OD490)。

1.7 Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲

采用Transwell chamber進行細胞遷移和侵襲實驗。寡核苷酸轉染細胞后培養48 h,消化收集細胞,調整細胞密度為2×105個/ml,向Transwell上室中加入200 μl細胞懸液,下室中加入500 μl含15%胎牛血清的DMEM,培養24 h,取出Transwell,刮去濾膜表面細胞,遷移至濾膜背面的細胞以4%多聚甲醛固定后進行結晶紫染色,光學顯微鏡下計數遷移細胞。對于細胞侵襲實驗,需預先采用Matrigel基質膠包被Transwell濾膜,細胞接種后需培養48 h,其余步驟與遷移實驗相同。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 miR-655-3p在胃癌細胞系中的表達

為分析比較miR-655-3p在胃癌細胞系中的表達,以永生化胃黏膜上皮細胞系GES-1為對照,采用qRT-PCR檢測了3種不同分化程度胃癌細胞系中miR-655-3p的表達水平,結果表明:與GES-1細胞相比,miR-655-3p在高度分化的MKN-28胃癌細胞中表達較高,在中度分化的SGC-7901胃癌細胞中表達次之,在低度分化的BGC-823胃癌細胞中表達最低(P<0.05,見圖1)。

2.2 轉染agomiR-655-3p后miR-655-3p的過表達水平檢測

將agomiR-655-3p寡核苷酸轉染BGC-823胃癌細胞后,采用qRT-PCR對轉染效果進行鑒定,結果表明:與陰性對照(NC)組比較,轉染agomiR-655-3p顯著提高了BGC-823細胞中成熟miR-655-3p的表達水平,是對照組的35.3倍(P<0.05,見圖2)。

與GES-1細胞比較,*P<0.05圖1 miR-655-3p在胃癌細胞系中的表達Figure 1 Expression of miR-655-3p in gastric cancer cell lines

與陰性對照(NC)組比較,*P<0.05圖2 過表達miR-655-3p的效果鑒定Figure 2 Identification of miR-655-3p overexpression

2.3 過表達miR-655-3p對BGC-823胃癌細胞增殖的影響

將agomiR-655-3p寡核苷酸轉染BGC-823胃癌細胞后,采用MTT法檢測過表達miR-655-3p對細胞增殖的影響,結果表明:與陰性對照(NC)組比較,agomiR-655-3p明顯抑制了BGC-823細胞增殖(P<0.05,見圖3)。

2.4 過表達miR-655-3p對BGC-823胃癌細胞遷移的影響

將agomiR-655-3p寡核苷酸轉染BGC-823胃癌細胞后,應用Transwell檢測過表達miR-655-3p對細胞遷移能力的影響,結果表明:與陰性對照(NC)組比較,過表達miR-655-3p具有降低BGC-823細胞遷移能力的作用,每個視野遷移細胞數由223±15降低至117±9(P<0.05,見圖4)。

2.5 過表達miR-655-3p對BGC-823胃癌細胞侵襲的影響

將agomiR-655-3p寡核苷酸轉染BGC-823胃癌細胞后,用Transwell檢測過表達miR-655-3p對細胞侵襲能力的影響,結果表明:與陰性對照(NC)組比較,過表達miR-655-3p顯著抑制了BGC-823細胞的侵襲能力,每個視野侵襲細胞數由124±14降低至61±6(P<0.05,見圖5)。

與陰性對照(NC)組比較,*P<0.05圖3 過表達miR-655-3p對胃癌細胞增殖的影響Figure 3 Effect of miR-655-3p overexpression on gastric cancer cell proliferation

與陰性對照(NC)組比較,*P<0.05圖4 過表達miR-655-3p對胃癌細胞遷移的影響Figure 4 Effect of miR-655-3p overexpression on gastric cancer cell migration

與陰性對照(NC)組比較,*P<0.05圖5 過表達miR-655-3p對胃癌細胞侵襲的影響Figure 5 Effect of miR-655-3p overexpression on gastric cancer cell invasion

3 討論

許多研究已證實miRNA與胃癌的分化程度、腫瘤大小、轉移狀況、幽門螺桿菌感染等各種臨床特征及預后緊密關聯,其中既包括促癌miRNA的表達增高,如miR-17、mir-19a、miR-20a、miR-21、miR-25、miR-27a、miR-106a、miR-106b、miR-200b、miR-215、miR-222等,又包括抑癌miRNA的表達降低,如let-7a、miR-143、miR-148a、miR-200c、miR-204、miR-218、miR-433等[5]。

目前,有關miR-655-3p的研究報道較少[3,4]。已知miR-655-3p基因定位于染色體14q32,該位點已鑒定出4個miRNA分子,除miR-655-3p外還包括miR-127-5p、miR-369-3p和miR-544a。采用乳腺癌肺轉移模型證實miR-127-5p、miR-544a和miR-655-3p能夠通過靶向轉移生長因子β受體2(TGFBR2)和Rho關聯卷曲螺旋蛋白激酶2(ROCK2)而抑制腫瘤細胞的黏附、侵襲和轉移[6]。miR-655-3p在肝癌組織和細胞中表達明顯降低,與腫瘤大小、門靜脈癌栓形成、TNM分期、腫瘤轉移等顯著相關,過表達miR-655-3p能夠靶向解整合素樣金屬蛋白酶10(ADAM10)而抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲[4]。此外,肝癌組織中miR-655-3p的表達水平與患者生存期相關,是肝癌預后的獨立危險因素[7]。在肝癌細胞中證實ATP結合盒轉運體G2(ABCG2)是miR-655-3p的靶分子,而ABCG2是介導腫瘤多藥耐藥性的重要蛋白,這提示miR-655-3p與腫瘤耐藥性相關[8]。

綜上所述,現有的研究進展證實miR-655-3p屬于抑癌miRNA分子。據此,本研究檢測了miR-655-3p在永生化胃黏膜上皮細胞系GES-1和3種不同分化程度胃癌細胞系中的表達水平,結果表明,隨著胃癌細胞系的分化程度下降,miR-655-3p的表達水平也不斷降低,這提示miR-655-3p的表達水平與胃癌細胞的分化程度之間具有正相關關系。隨后以miR-655-3p表達水平最低的BGC-823胃癌細胞系為模型,證實過表達miR-655-3p能夠抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。本研究結果表明miR-655-3p具有抑制胃癌細胞惡性表型的作用,其體內抑癌作用和相關分子機制有待下一步研究。

[1] Ang TL, Fock KM. Clinical epidemiology of gastric cancer[J]. Singapore Med J, 2014, 55(12):621-628.

[2] Wang QX, Zhu YQ, Zhang H,etal. Altered MiRNA expression in gastric cancer: a systematic review and meta-analysis[J]. Cell Physiol Biochem, 2015, 35(3):933-944.

[3] Chang P, Wang X, Zhou Y,etal. Analysis of the correlation between the expression of miR-655 and esophageal cancer prognosis[J]. Oncol Lett, 2017, 13(6):4691-4694.

[4] Wu G, Zheng K, Xia S,etal. MicroRNA-655-3p functions as a tumor suppressor by regulating ADAM10 and β-catenin pathway in Hepatocellular Carcinoma[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2016, 35(1):89.

[5] da Silva Oliveira KC, Thomaz Araújo TM, Albuquerque CI,etal. Role of miRNAs and their potential to be useful as diagnostic and prognostic biomarkers in gastric cancer[J]. World J Gastroenterol, 2016, 22(35):7951-7962.

[6] Uppal A, Wightman SC, Mallon S,etal. 14q32-encoded microRNAs mediate an oligometastatic phenotype[J]. Oncotarget, 2015, 6(6):3540-3552.

[7] Zhao XQ, Liang B, Jiang K,etal. Down-regulation of miR-655-3p predicts worse clinical outcome in patients suffering from hepatocellular carcinoma[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2017, 21(4):748-752.

[8] Awortwe C, Kaehler M, Rosenkranz B,etal. MicroRNA-655-3p regulatesEchinaceapurpureamediated activation of ABCG2[J]. Xenobiotica, 2017:Epub ahead of print.

EffectsofmiR-655-3pongastriccancercellproliferation,migrationandinvasion

YUAN Shanshan,ZHANG Yanting,ZHANG Xin,ZUO Liping,ZHUANG Kun,TANG Hailing*
(DepartmentofGastroenterology,Xi’anCentralHospital,Xi’anJiaotongUniversity,Xi’an710003,China;*Correspondingauthor,E-mail:xasthl@163.com)

ObjectiveTo investigate the effects of miR-655-3p on proliferation, migration and invasion of gastric cancer cells.MethodsThe expression levels of miR-655-3p in GES-1, MKN-28, SGC-7901 and BGC-823 cell lines were detected by qRT-PCR. After transfection of agomiR-655-3p, overexpression of miR-655-3p was verified by qRT-PCR. The effect of miR-655-3p overexpression on gastric cancer cell proliferation was detected by MTT assay. The effects of miR-655-3p overexpression on gastric cancer cell migration and invasion were detected by Transwell assay.ResultsThe expression of miR-655-3p decreased in MKN-28, SGC-7901 and BGC-823 cell lines compared to that in GES-1 cell line(P<0.05),and the lowest in poorly differentiated BGC-823 cell line. The expression level of mature miR-655-3p in BGC-823 cells increased by 35.3 times after transfection of agomiR-655-3p(P<0.05). The BGC-823 cell proliferation was inhibited by miR-655-3p overexpression(P<0.05). The BGC-823 cell migration and invasion were decreased by miR-655-3p overexpression. Migration cells per field decreased from 223±15 to 117±9(P<0.05), and invasion cells per field decreased from 124±14 to 61±6(P<0.05).ConclusionOverexpression of miR-655-3p can inhibit BGC-823 gastric cancer cell proliferation, migration and invasion.

gastric cancer; miR-655-3p; cell proliferation; cell migration; cell invasion

國家自然科學基金資助項目(81502084)

原姍姍,女,1984-03生,碩士,主治醫師,E-mail:xasyuanss@126.com.

2017-10-24

R735.2

A

1007-6611(2017)12-1245-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.12.010