老年慢性腎衰大鼠心肌缺血預處理后胎盤生長因子的表達及其意義

董星彤,賈 強,付文靜,鄧英輝,劉 華,林 娜(首都醫科大學宣武醫院腎內科,北京 100053;通訊作者,Email:2008happyqiang@sina.com)

老年慢性腎衰大鼠心肌缺血預處理后胎盤生長因子的表達及其意義

董星彤,賈 強*,付文靜,鄧英輝,劉 華,林 娜
(首都醫科大學宣武醫院腎內科,北京 100053;*通訊作者,E-mail:2008-happyqiang@sina.com)

目的 觀察老年慢性腎衰大鼠經過心肌缺血預處理(ischemic preconditioning,IPC)后心肌組織胎盤生長因子(placental growth factor,PlGF)的表達,探討PlGF在老年慢性腎衰大鼠心肌損傷修復中可能的作用。 方法 20月齡雄性SD大鼠16只,全部進行腎大部分切除(Platt法)制備慢性腎衰模型,隨即分成IPC組和假手術組,每組8只。IPC組:結扎冠狀動脈前降支使其缺血6 min,隨后再灌注6 min,反復4次;假手術(sham)組:開胸操作同IPC組,但不阻斷冠脈血流。術后12 h,麻醉后取兩組大鼠心臟組織,分別用Western blot及免疫組化法檢測PlGF在心肌組織中蛋白表達水平。 結果 Western blot方法測定IPC組中邊緣區心肌組織中、缺血區域心肌組織中PlGF表達水平均較假手術組及IPC組非缺血區明顯增高(P<0.01)。免疫組化染色顯示IPC組心肌組織中PlGF表達水平較假手術組明顯增高(P<0.01)。 結論 經IPC處理后,老年慢性腎衰大鼠心肌組織中PlGF表達增高,提示IPC在老年慢性腎衰大鼠中PlGF可能在缺血心肌保護過程中的一個重要作用。

心肌缺血預處理; 胎盤生長因子; 慢性腎衰竭; 大鼠

冠狀動脈硬化性心臟病(冠心病)是在我國城鎮居民除惡性腫瘤及腦血管病以外的主要死亡原因之一,而在老年人更是冠心病的高發人群。患有慢性腎衰的冠心病老年患者,由于其腎功能的受損,冠脈內支架植入術、冠狀動脈旁路移植術、經皮冠狀動脈血管成形術等各種冠心病的治療手段的使用受到限制,往往得不到及時有效的治療,最終影響生活質量甚至危及生命。作為目前機體內較強大的心肌缺血損傷自我防御機制,缺血預處理(ischemic preconditioning,IPC)對心肌缺血性損傷的內源性保護是目前冠心病臨床治療的新思路。因此,研究冠心病高發的老年慢性腎衰患者的心肌缺血損傷防御機制也可能為這部分患者的臨床治療提供新的可能。IPC是指短暫的、非致死性的心肌缺血,通過促發機體自身的血管生成過程,增加缺血區心肌的單位面積毛細血管密度,可以使心肌對隨后致死性的心肌缺血的抵抗力增強[1-3]。缺血預處理現象,是指短暫的、非致死性的心肌缺血可以使心肌對隨后致死性的心肌缺血的抵抗力增強。研究發現,IPC存在早期相(early IPC,EIPC)和延遲相(delayed IPC,DIPC),早期相在IPC后立即開始,持續1-2 h;延遲相在IPC后6-12 h開始,24-48 h作用達高峰,且DIPC可以提供比EIPC更持久和強大的保護作用。研究表明IPC的促血管生成作用有多種因子參與,如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),而胎盤生長因子(placental growth factor,PlGF)是VEGF家族中的一個成員。它于1991年由Maglione等[4]在人類胎盤中發現。PlGF在正常妊娠胎盤及母血中呈高表達狀態[5-8]。此外,心肌細胞[9,10]、血管內皮細胞和平滑肌細胞[11,12]中也均有PlGF的表達;激活或者應激狀態下腫瘤細胞、骨髓細胞、炎癥細胞、神經元細胞及平滑肌細胞在也產生大量P1GF[9,13],PlGF可通過一系列復雜的信號轉導過程促進內皮細胞遷移、生長和存活直接刺激血管新生[14],促進平滑肌細胞增殖和募集使血管成熟[15]等進而促進血管生成。此外,PlGF能夠通過調高Flt-1、VEGF-A和VEGF-2的表達,協同VEGF-A產生重要的血管生成效應[5]。由于IPC與PlGF均有刺激血管生成的作用,目前對于PlGF與IPC的缺血心肌保護作用是否直接相關,IPC是否會啟動這一因子對缺血心肌的保護作用,迄今尚無相關的研究。

本研究旨在觀察老年慢性腎衰大鼠中IPC后PlGF表達的變化,并探討其是否可能為老年慢性腎衰患者合并冠心病的治療提供新思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象及實驗分組

16只20月齡雄性SD大鼠,SPF級,由北京維通利華公司[SCXK(京)2012-0001]提供,體質量(600±20)g。

老年大鼠隨機分為2組:IPC組(n=8,于IPC后12 h麻醉后摘除心臟取材);假手術(sham)組(n=8,于模型制備完成后12 h麻醉后摘除心臟取材)。

1.2 結扎老年慢性腎衰大鼠冠脈前降支建立心肌缺血預處理模型

按照經典Platt法[6]制作慢性腎衰模型。用2%戊巴比妥鈉按40 mg/kg劑量腹腔注射麻醉。大鼠左腎切除2/3,術后10 d行右腎全切除。在老年慢性腎衰大鼠建立成功后將大鼠隨機分為IPC組及sham組。IPC模型的制作參照文獻[9]的方法并稍作修改。抽取1%的戊巴比妥鈉,按照50 mg/kg對大鼠進行腹腔注射麻醉,進行氣管插管連接呼吸機輔助呼吸,連接心電監護儀并以Ⅱ導聯進行心電監護。開胸,暴露出心臟,在冷光源聚光燈照射下找到冠狀動脈前降支(left anterior descending artery,LAD),用細針穿線于左心耳下緣約2 mm處后將縫線穿過中心有孔的圓形塑料片及中心為空的小圓柱形塑料管,將縫線提起,用止血鉗夾緊縫線并下壓塑料管以阻斷冠脈血流6 min,然后松開止血鉗,使血流再通6 min,如此反復4次完成IPC過程。以心電圖ST段逐漸抬高作為缺血成功的標志,以心電圖出現再灌注心律失常作為心肌再灌注成功標志。完成IPC后,保留縫線并關胸。IPC組只進行IPC處理,操作完成后保留縫線并關胸。假手術組開胸后于冠狀動脈前降支下穿線,但不阻斷冠狀動脈血流即不造成心肌缺血,將心臟曝露約48 min后關胸。

1.3 大鼠心臟標本留取

1.4 Western blot方法檢測心肌組織中PlGF的蛋白表達

在研缽內倒入少量液氮,放入心肌組織100 mg研碎,隨后進行離心。然后用BCA法測蛋白濃度。制備15% SDS-PAGE分離膠及5% SDS-PAGE濃縮膠。加入PlGF樣品,隨后進行電泳及電轉。電轉結束后將取下NC膜,在搖床上室溫封閉1 h,進行一抗、二抗反應,用Odyssey紅外成像系統檢測熒光條帶并分析條帶灰度。

1.5 免疫組織化學法檢測缺血心肌中PlGF的表達

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 老年慢性腎衰大鼠術后12 h心肌組織中PlGF蛋白表達情況

本研究用Western blot方法檢測了IPC組及假手術組老年慢性腎衰大鼠術后12 h這一時間點的心肌組織中PlGF蛋白的表達情況,以β-actin為內參。sham老年慢性腎衰大鼠術后12 h PlGF表達水平極低,IPC組中的非缺血區域的心肌組織PlGF蛋白表達水平與sham組近似,而IPC組中邊緣區心肌組織中、缺血區域心肌組織中PlGF表達水平均較假手術組及IPC組非缺血區明顯增高(P<0.01,見圖1)。2.2 免疫組織化學法測定老年慢性腎衰大鼠IPC組缺血心肌組織中PlGF表達IPC組心肌組織中PlGF表達水平均較假手術組明顯增高(P<0.01,見圖2)。

3 討論

臨床研究發現,如果患者在發生心肌梗死之前出現前驅心絞痛癥狀,那么這類患者的心梗面積會比發生心肌梗死前未發生前驅心絞痛癥狀的患者的心梗面積小,預后也較好,這是IPC對缺血的心肌進行保護的表現之一[8-11]。在大量的基礎實驗中,IPC也被證實具有減少心肌細胞的凋亡和壞死、縮小心肌梗死面積的作用。Kawata等[1]通過大鼠心肌梗死模型研究發現缺血預處理通過增加心肌缺血區VEGF的表達,促進血管生成發揮心肌保護作用。

圖1 老年慢性腎衰大鼠IPC和假手術組術后12 h心肌組織中PlGF蛋白的表達 (n=8)Figure 1 Expression of PlGF in senior CRF rats at 12 h after operation in sham group and IPC group (n=8)

圖2 老年慢性腎衰大鼠術后12 h心肌組織PlGF表達的免疫組化染色(DAB顯色,蘇木素復染,×200)Figure 2 Immunohistochemical staining for PlGF in myocardial tissue of senior CRF rats at 12 h after ope-ration (DAB,×200)

另一研究表明抑制VEGF的表達及VEGF介導的信號反應,血管生成明顯減少,缺血預處理的心肌保護作用顯著減弱[12]。

VEGF家族中的PlGF在各個生理或病理條件下的促血管新生作用受到廣泛研究。目前的研究表明,在惡性腫瘤[13]、缺血性疾病、軟骨和骨修復類風濕性關節炎等多種疾病中PlGF都通過促血管新生發揮作用。PlGF通過結合其相應受體Flt-1[12],激活一系列下游信號轉導通路,最終促進血管生成。此外,PlGF還能協同VEGF-A產生重要的血管生成效應[7]。Wu等[16]在給予豬心肌缺血模型應用重組PlGF-2后觀察到PlGF-2不僅可以促進局部心肌的血供,還可以增強心肌收縮力以及改善心功能。Pan等[17]對急性心梗大鼠模型給予外源性PlGF注射,結果證明大鼠心肌血管再生增強,心肌細胞凋亡減少。

既往關于PlGF與心肌缺血的研究均在單純心肌缺血條件下進行,本研究的新穎之處在于利用制備的在體老年慢性腎衰IPC模型觀察經IPC處理后的老年慢性腎衰大鼠心肌組織中PlGF的表達情況。實驗表明:經過IPC處理的老年慢性腎衰大鼠的心肌組織中PlGF的表達明顯較假手術組高。其中Western blot結果顯示在術后12 h這個時間點,IPC組老年慢性腎衰大鼠心肌組織中缺血心肌的邊緣區域及缺血區域的心肌組織中PlGF的表達水平均較遠離缺血區域的心肌組織及假手術組高。免疫組織化學法測定假手術組和IPC組心肌組織PlGF表達情況顯示在術后12 h,IPC組老年慢性腎衰大鼠心肌組織著色較假手術組深,提示IPC組PlGF表達高于假手術組。上述現象顯示對老年腎衰大鼠給予缺血預處理刺激后,具有血管再生作用的PlGF表達增多,提示PlGF可能通過促進血管新生對對缺血心肌產生保護作用,即PlGF可能是IPC對心肌缺血保護過程的一個重要因子。此外,也為心血管疾病高發的老年腎衰患者提供了臨床治療的新思路。

[1] Kawata H, Yoshida K, Kawamoto A,etal. Ischemic preconditioning upregulates vascular endothelial growth factor mRNA expression and neovascularization via nuclear translocation of protein kinase C epsilon in the rat ischemic myocardium[J]. Circ Res, 2001, 88(7):696-704.

[2] Maulik N. Ischemic preconditioning mediated angiogenic response in the heart[J]. Antioxid Redox Signal, 2004, 6(2):413-421.

[3] Thirunavukkarasu M, Han Z, Zhan L,etal. Adeno-sh-b-Cat-enin abolishes ischemic preconditioning-mediated cardioprotection by down-regulation of its target genes VEGF, Bcl-2, and Survivin in ischemic rat myocardium[J]. Antioxid Redox Signal, 2008, 10(8):1475-1485.

[4] Cao Y, Ji WR, Qi P,etal. Placental growth factor: identification and characterization of a novel isoform generated by RNA alternative splicing[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1997, 235(3):493-498.

[5] Roy H, Bhardwaj S, Babu M,etal. Adenovirus-mediated gene transfer of placental growth factor to perivascular tissue induces angiogenesis via upregulation of the expression of endogenous vascular endothelial growth factor-A[J]. Hum Gene Ther, 2005, 16(12):1422-1428.

[6] Sanchez-Lozada LG, Tapia E, Soto V,etal. Effect of febuxostat on the progression of renal disease in 5/6 nephrectomy rats ith and without hyperuriceia[J]. Nephron Physiol, 2008, 108(4):69-78.

[7] Zheng J, Chin A, Duignan I,etal. Growth factor-mediated reversal of senescent dysfunction of ischemia-induced cardioprotection[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol,2006,290(2):H525-530.

[8] Bartling B, Friedrich I, Silber RE,etal. Ischemic preconditioning is not cardioprotective in senescent human myocardium[J]. Ann Thorac Surg, 2003, 76(1):105-111.

[9] Wojtovich AP, Nadtochiy SM, Brookes PS,etal. Ischemic preconditioning: the role of mitochondria and aging[J]. Exp Gerontol, 2012, 47(1):1-7.

[10] Liu L, Zhu J, Glass PS,etal. Age-associated changes in cardiac gene expression after preconditioning[J]. Anesthesiology, 2009, 111(5):1052-1064.

[11] Xaymardan M, Zheng J, Duignan I,etal. Senescent impairment in synergistic cytokine pathways that provide rapid cardioprotection in the rat heart[J]. Exp Med, 2004, 199(6):797-804.

[12] Malik A, Baldwin ME, Peale F,etal. Redundant roles of VEGF-B and PlGF during selective VEGF-A blockade in mice[J]. Blood, 2006, 107(2):550-557.

[13] Tarallo V, Tudisco L, De Falco S. A placenta growth factor 2 variant acts as dominant negative of vascular endothelial growth factor A by heterodimerization mechanism[J]. Am J Cancer Res, 2011, 1(2):265-274.

[14] Torry RJ, Tomanek RJ, Zheng W,etal. Hypoxia increases placental growth factor expression in human myocardium and cultured neonatal rat cardiomyocytes[J], Heart Lung Transplant, 2009, 28(2):183-190.

[15] Bellik L, Vinic MC, Filippi S,etal. Intracellular pathways triggered by the selective FLT-1-agonist placental growth factor in vascular smooth muscle cells exposed to hypoxia[J]. Br J Pharmacol, 2005, 146(4):568-575.

[16] Wu M, Claus P, Vanden Driessche N,etal. Placental growth factor 2-A potential therapeutic strategy for chronic myocardial ischemia[J]. Int J Cardiol, 2016(203):534-542

[17] 泮輝，呂望，王一青，等.胎盤生長因子恢復急性心肌梗死大鼠心功能及其機制[J].浙江大學學報(醫學版),2012，43(4)：441-447.

Expressionofplacentalgrowthfactoraftermyocardialischemicpreconditioninginseniorratswithchronicrenalfailureanditspotentialrole

DONG Xingtong,JIA Qiang*,FU Wenjing,DENG Yinghui,LIU Hua,LIN Na
(DepartmentofNephrology,XuanwuHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100053,China;*Correspondingauthor,E-mail:2008-happyqiang@sina.com)

ObjectiveTo observe the expression of placental growth factor(PlGF) after myocardial ischemic preconditioning(IPC) in rats with chronic renal failure(CRF), and to explore the potential protective role of placental growth factor in myocardial damage repair of senior rats with CRF.MethodsSixteen senior rats(20 months old) underwent 5/6 nephrectomy(Platt method), then were randomly divided into IPC group(n=8) and sham group(n=8). The rats were given LAD ligation for 6 min and reperfusion for 6 min, and then repeated four times in IPC group.The rats only underwent thracotomy but no blood flow blocking in sham group. Rat hearts were collected at 12 h after surgery to detect the expression of PlGF protein by Western blot and immunohistochemistry.ResultsWestern blot results showed the expression level of placental growth factor protein in peri-ischemia area and ischemic area at 12 h after IPC was significantly higher in IPC group than in sham group(P<0.01). Immunohistochemical staining revealed that the expression level of placental growth factor protein at 12 h after IPC was significantly higher in IPC group than in sham group(P<0.01).ConclusionThe expression level of placental growth factor increases in senior CRF rats after IPC, which suggests that placental growth factor might be a critical factor in the protective process of IPC to ischemic heart in senior rats with CRF.

ischemic preconditioning; placental growth factor; chronic renal failure; rats

董星彤,女,1986-03生,碩士,住院醫師,E-mail:923209667@qq.com

2017-03-13

R692.5

A

1007-6611(2017)12-1217-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.12.003