10批不同產(chǎn)地六棱菊中咖啡酸的工藝優(yōu)化與含量測定Δ

魏江存，陳勇，謝臻，李耀華，唐春麗，闕祖亮，庾延和，張昕，龐丹清（.廣西中醫(yī)藥大學藥學院，南寧53000；.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥學部，南寧5300）

10批不同產(chǎn)地六棱菊中咖啡酸的工藝優(yōu)化與含量測定Δ

魏江存1＊，陳勇1#，謝臻1，李耀華1，唐春麗2，闕祖亮1，庾延和1，張昕1，龐丹清1（1.廣西中醫(yī)藥大學藥學院，南寧530020；2.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥學部，南寧530022）

目的：優(yōu)化六棱菊中咖啡酸提取工藝，并建立其含量測定方法。方法：以回流提取法提取六棱菊中咖啡酸。以提取含量為考察指標，設計正交試驗，考察乙醇體積分數(shù)、料液比及提取時間對咖啡酸提取的影響，優(yōu)化提取工藝條件。采用高效液相色譜法，以咖啡酸為對照品，在320 nm波長下測定10批不同產(chǎn)地六棱菊藥材中的咖啡酸含量。結果：優(yōu)化的提取工藝條件為乙醇體積分數(shù)為10%、料液比為1∶40、提取時間為3 h。以此條件對咖啡酸進行工藝驗證試驗，六棱菊中咖啡酸平均含量為0.521 1 mg/g（RSD＝1.18%，n＝3）。10批不同產(chǎn)地六棱菊藥材中咖啡酸含量在0.375 2～0.776 6 mg/g之間，含量差異較大。結論：六棱菊藥材中咖啡酸含量與產(chǎn)地和采收季節(jié)等有關。本試驗優(yōu)選工藝提取咖啡酸重復性較好；建立的咖啡酸含量測定方法穩(wěn)定、可行。

六棱菊；含量測定；咖啡酸；高效液相色譜法

六棱菊[Laggera alata（D.Don）Sch.Bip.ex Oliv]系菊科六棱菊屬植物，全草入藥，性苦、辛，微溫，有祛風、除濕、解毒之功效，在民間作為抗菌消炎、清熱解毒的良藥，主要分布于我國東部、東南部至西南部，北至安徽和湖北[1]。因六棱菊新鮮的枝葉揉搓后散發(fā)特殊的臭味，民間稱之為“臭靈丹”[2]，以“臭靈丹”為主的許多復方制劑在臨床上應用也取得較好的療效[3-5]。目前，六棱菊多應用于急性扁桃體炎[6]、感冒[7]、病毒感染[8]等的治療。

六棱菊主要含倍半萜類、黃酮類、酚酸類等化學成分[2，9-12]，具有治療急慢性炎癥、抗腫瘤、抗病毒和抗微生物活性等功效[2]。其中，咖啡酸屬于酚酸類化合物，在金銀花、野菊花和蒲公英等植物中廣泛分布。咖啡酸具有多種藥理作用[13]，主要包括保護心血管、調節(jié)免疫、降脂、降糖、利膽止血等。以咖啡酸作為指標性成分進行含量測定，可以為六棱菊藥材的質量標準奠定基礎，然而國內(nèi)外未見對其進行含量測定的相關報道。本試驗不僅建立了六棱菊中咖啡酸的含量測定方法，還同時測定了廣西壯族自治區(qū)內(nèi)10批不同產(chǎn)地六棱菊中咖啡酸的含量，并比較不同產(chǎn)地藥材中咖啡酸含量差異，為六棱菊藥材的質量評價提供參考。

1 材料

1.1 儀器

2695高效液相色譜儀，包括2489紫外檢測器、四元泵、真空脫氣泵、自動進樣器、柱溫箱和Empower3工作站（美國Waters公司）；Simplicity純水系統(tǒng)（密理博中國有限公司）；Practum224-1CN分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；DHG-9203A電熱恒溫鼓風干燥箱、HWS-26電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學儀器有限公司）；TGL-16G高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；0.45 μm微孔濾膜（天津市津騰實驗設備有限公司）。

1.2 試劑與藥材

咖啡酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：1110885-200102，純度：＞98.0%）；乙腈為色譜純，甲醇和磷酸為分析純，試驗用水為純水。所有六棱菊藥材樣品均經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學藥學院田輝教授鑒定為菊科六棱菊屬植物六棱菊[Laggera alata（D.Don）Sch.Bip.ex Oliv]的全草。六棱菊樣品信息見表1。

表1 廣西壯族自治區(qū)內(nèi)10批不同產(chǎn)地的六棱菊樣品信息Tab 1Sample information of 10 batches of L.alatafromdifferentareasinGuangxi Zhuang Autonomous Region

2 方法與結果

2.1 六棱菊中咖啡酸提取工藝優(yōu)化

2.1.1 單因素考察（1）提取方法考察。從六棱菊中提取咖啡酸的方法主要有回流提取法、超聲提取法、浸漬法、滲漉法、煎煮法等[14]。以咖啡酸提取時間1 h、料液比1∶40、提取溶劑45%乙醇為提取條件，分別采用回流提取法、超聲提取法和溶劑浸漬法提取六棱菊中的咖啡酸。結果，回流提取法對咖啡酸提取率較高，故采用回流提取法。（2）乙醇體積分數(shù)考察。固定咖啡酸提取時間為3 h、料液比為1∶40，采用回流提取法，以乙醇體積分數(shù)為10%、25%、45%、65%、95%提取六棱菊中咖啡酸并計算得率。結果，25%乙醇回流提取率較高，但與10%乙醇提取效果差別不大。從減少乙醇溶劑方面考慮，選用10%乙醇為提取體積分數(shù)。（3）料液比考察。固定咖啡酸提取時間為3 h、乙醇體積分數(shù)為10%，采用回流提取法，以料液比為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60提取六棱菊中咖啡酸并計算得率。結果，料液比為1∶40時咖啡酸得率較高，故選用料液比為1∶40。（4）提取時間考察。固定料液比為1∶40、乙醇體積分數(shù)為10%，采用回流提取法，以提取時間為1.0、2.0、2.5、3.0、3.5 h提取六棱菊中咖啡酸并計算得率。結果，提取時間為2.5 h時咖啡酸得率較高，故選用提取時間為2.5 h。

2.1.2 正交試驗設計根據(jù)文獻[15]和參考2015年版《中國藥典》（一部），以乙醇體積分數(shù)（A，%）、料液比（B，g/mL）、提取時間（C，h）為考察因素，以咖啡酸含量作為評價指標，按3因素3水平選用L9（34）正交表進行試驗。各因素水平及試驗結果見表2、表3，方差分析結果見表4。

表2 因素與水平Tab 2Factors and levels

表3 正交試驗設計與結果Tab 3Orthogonal test design and results

表4 方差分析結果Tab 4Result of variance analysis

由表3可知，各提取因素對六棱菊提取工藝的影響順序為A＞C＞B，即乙醇體積分數(shù)對六棱菊的提取工藝影響最大，其次是提取時間，最后是料液比。由表4可知，乙醇體積分數(shù)對六棱菊提取具有顯著影響，而料液比和提取時間無顯著影響，所以對六棱菊中咖啡酸成分提取效果有顯著影響的因素是乙醇體積分數(shù)。因此，本試驗最理想的提取方案是A1B3C3，即乙醇體積分數(shù)為10%、料液比為1∶40、提取時間為3 h時，提取效果最佳。

2.1.3 工藝驗證試驗以優(yōu)選出的咖啡酸提取條件進行六棱菊中咖啡酸提取的驗證試驗。分別稱取3份六棱菊藥材粉末，分別為0.500 6、0.500 1，0.500 9 g，按“2.2.3”項下方法制備成供試品溶液，平行進行3次測定。計算六棱菊中咖啡酸含量分別為0.521 4、0.514 8、0.527 1 mg/g，平均含量為0.521 1 mg/g，RSD＝1.18%（n＝3）。驗證試驗表明，優(yōu)化后的咖啡酸提取條件較好，工藝可行。

2.2 高效液相色譜法測定六棱菊中咖啡酸的含量

按文獻[15-16]和參考2015年版《中國藥典》（四部）方法測定含量。2.2.1色譜條件色譜柱為Inertsil ODS-3 C18柱（250 mm×4.60 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.1%磷酸（22∶78，V/V）；流速為1.0 mL/min；檢測波長為320 nm；柱溫為30℃；進樣量為10 μL。按照上述條件測定，各組分分離度良好，見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1HPLC chromatograms

2.2.2 對照品溶液的制備精密稱取咖啡酸對照品16.2 mg，置于20 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得咖啡酸對照品貯備液，質量濃度為0.81 mg/mL。精密量取上述咖啡酸對照品貯備液2 mL，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶液稀釋至刻度，即得咖啡酸對照品溶液，質量濃度為64.8 μg/mL。精密量取上述對照品溶液2 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶液稀釋至刻度，即得咖啡酸對照品溶液，質量濃度為12.96 μg/mL，此咖啡酸濃度用于做線性方程。

2.2.3 供試品溶液的制備精密稱取六棱菊藥材粉末0.5 g，使用10%乙醇提取，回流，以離心半徑0.65 cm、13 000 r/min離心10 min，取上清液，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.4 方法學考察按相關方法進行檢測。結果顯示，所用色譜條件分離效果良好，提取溶劑對咖啡酸測定無干擾，咖啡酸出峰時間為6.8 min。以咖啡酸進樣量為橫坐標（x）、峰面積為橫坐標（y）進行線性回歸，得回歸方程為y＝4×106x－22 912（r＝0.999 1），檢測限為10.60μg/mL，咖啡酸進樣量的線性范圍為0.025 92～0.259 2μg；精密度試驗中，RSD＝2.25%（n＝6）；穩(wěn)定性試驗中，樣品溶液室溫放置24 h的峰面積RSD＝1.77%（n＝6）；重復性試驗中，六棱菊中咖啡酸平均含量為0.455 2mg/g，RSD＝2.86%（n＝6）；加樣回收試驗中，低、中、高加樣量（0.182 1、0.227 6、0.273 1 mg）的六棱菊中咖啡酸的平均回收率分別為98.33%、97.18%、100.07%，RSD分別為1.85%、2.07%、1.31%（n＝3），均符合相關要求。2.2.5樣品含量測定分別稱取10批不同產(chǎn)地的六棱菊藥材粉末（過2號篩）0.5 g，精密稱定，按“2.2.3”項下的方法制備成供試品溶液，按“2.2.1”項下條件測定，采用外標一點法計算咖啡酸的含量，結果見表5。

表5 廣西壯族自治區(qū)內(nèi)10批不同產(chǎn)地的六棱菊樣品中咖啡酸含量測定結果Tab 5Content determination results of caffeic acid in 10 batches of L.alata from different areas in Guangxi Zhuang Autonomous Region

由表5可知，廣西壯族自治區(qū)內(nèi)10批不同產(chǎn)地的六棱菊藥材中均含有咖啡酸，且咖啡酸含量差異較大，其含量范圍為0.375 2～0.776 6 mg/g；其中百色市靖西縣的六棱菊藥材所含咖啡酸含量最高，明顯高于其他產(chǎn)地樣品，其次是百色市田陽縣、桂林市荔浦縣樣品，而桂林市平樂縣樣品咖啡酸含量最低。六棱菊中的咖啡酸含量差異較大，可能是受六棱菊植物生長期與生長環(huán)境的共同作用，影響其生長和咖啡酸成分的積累。若僅以咖啡酸成分作為六棱菊藥材質量評價的依據(jù)，六棱菊的最佳產(chǎn)地是百色市靖西縣。

3 討論

3.1 流動相的選擇

本試驗過程中考察了甲醇-0.05%磷酸、甲醇-0.1%磷酸、甲醇-0.2%磷酸、甲醇-0.3%甲酸、乙腈-0.05%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸、乙腈-0.3%甲酸、甲醇-水、乙腈-水等系統(tǒng)對樣品成分分離效果的影響，結果，乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動相時，分離度較好，故流動相最終確定為乙腈-0.1%磷酸溶液。

3.2 檢測波長的選擇

采用二極管陣列檢測器，在200～400 nm波長下對供試品和對照品溶液進行全波長掃描，結果咖啡酸在291、320 nm波長下有最大吸收。考慮到291 nm作為檢測波長時，溶劑峰大，基線漂移；而用320 nm時，溶劑峰小，基線平穩(wěn)，咖啡酸響應值較大。故最終采用320 nm作為本試驗的檢測波長。

3.3 提取方法的選擇

本試驗過程中還考察了提取溶劑（甲醇、乙醇）、不同體積分數(shù)的乙醇（10%、45%、95%）、提取方法（超聲和加熱回流）和提取時間（1、2、3 h）對樣品提取結果的影響。結果，10%乙醇溶液加熱回流3 h提取效果好。

綜上，本試驗優(yōu)選工藝提取咖啡酸含量重復性較好；建立的咖啡酸含量測定方法穩(wěn)定、可行。

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Technology Optimization and Content Determination of Caffeic Acid in 10 Batches of Laggera alata from Different Areas

WEI Jiangcun1，CHEN Yong1，XIE Zhen1，LI Yaohua1，TANG Chunli2，QUE Zuliang1，YU Yanhe1，ZHANG Xin1，PANG Danqing1（1.College of Pharmacy，Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530020，China；2.Dept.of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530022，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of caffeic acid in Laggera alata，and establish a method for its content determination.METHODS：The caffeic acid in L.alata was extracted by reflux extraction.Using extraction content as investigation index，orthogonal test was used to investigate the effects of ethanol volume fraction，material-liquid ratio and extraction time on caffeic acid，and the extraction technology conditions were optimized.HPLC was adopted to determine the content of caffeic acid in 10 batches of L.alata from different areas，using caffeic acid as reference substance，at wavelength of 320 nm.RESULTS：The optimized extraction technology conditions were as follows as ethanol volume fraction of 10%，material-liquid ratio of 1∶40 and extraction time of 3 h.Under the condition，verification test for caffeic acid was carried out，and the average content of caffeic acid in L.alata was 0.521 1 mg/g（RSD＝1.18%，n＝3）.The content of caffeic acid in 10 batches of L.alata from different areas ranged in 0.375 2-0.776 6 mg/g，and the content showed great differences.CONCLUSIONS：The content of caffeic acid in L.alata is related to area and harvest season.The caffeic acid extration by optimized technology shows good reproducibility；and the established method for content determination is stable and feasible.

Laggera alata；Content determination；Caffeic acid；HPLC

R914.1

A

1001-0408（2017）34-4792-04

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.34.10

國家自然科學基金資助項目（No.81260673、81360524）；壯瑤藥協(xié)同創(chuàng)新中心項目（No.桂教科研〔2013〕20號）；廣西壯瑤藥重點實驗室項目（No.桂科基字〔2014〕32號）；廣西中醫(yī)藥大學科研創(chuàng)新項目（No.YJS201625）；廣西重點學科壯藥學項目（No.桂教科研〔2013〕16號）；廣西八桂學者中藥創(chuàng)新理論與藥效研究項目（No.J13162）；廣西高校中藥提取純化與質量分析重點實驗室項目（No.桂教科研〔2014〕6號）

＊碩士研究生。研究方向：藥物質量控制。電話：0771-3137585。E-mail：WJC2553@163.com

#通信作者：教授，碩士生導師。研究方向：中藥及其制劑質量分析。電話：0771-3137585。E-mail：cy6381@163.com

2017-01-24

2017-09-29）

（編輯：余慶華）