諾氟沙星對中國圓田螺氨基比林-N-脫甲基酶活性的影響

王宏偉，楊麗坤，趙文博，李林鋒，邢清朝，謝恒輝

( 1.河北大學 生命科學學院, 河北 保定 071002； 2.天津武清區楊村一中，天津 300000 )

諾氟沙星對中國圓田螺氨基比林-N-脫甲基酶活性的影響

王宏偉1，楊麗坤1，趙文博1，李林鋒1，邢清朝1，謝恒輝2

( 1.河北大學 生命科學學院, 河北 保定 071002； 2.天津武清區楊村一中，天津 300000 )

在沉積物中均勻加入諾氟沙星，模擬研究了沉積物中諾氟沙星對中國圓田螺不同組織氨基比林-N-脫甲基酶活性的影響。結果表明，諾氟沙星的處理使中國圓田螺各組織中的氨基比林-N-脫甲基酶活性發生了變化，不同和相同含量諾氟沙星對同種或不同組織中氨基比林-N-脫甲基酶的活性的影響不同。總的趨勢為：低含量諾氟沙星對肝、腎、胃等組織氨基比林-N-脫甲基酶活性的作用為前期誘導后期抑制；中、高含量諾氟沙星抑制腎、胃等組織氨基比林-N-脫甲基酶活性；諾氟沙星一直抑制卵巢和肌肉組織中氨基比林-N-脫甲基酶的活性。

中國圓田螺；諾氟沙星；氨基比林-N-脫甲基酶活性

諾氟沙星屬于氟喹諾酮類抗菌藥，近年廣泛用于防治水產養殖的病害[1]，但殘留物對環境的影響不可忽略，尤其是沉積物對底棲生物造成影響[2]。這些殘留物經過生物濃縮、生物放大等作用及食物鏈傳遞對人類健康也會有影響。中國圓田螺(Cipangopaludinachinensis)，俗稱螺螄、田螺，是中國各淡水水域的底棲生物，很多人喜食，對環境具有指示作用，但相應的研究工作很少。本試驗模擬中國圓田螺的生存環境，研究了沉積物中不同含量諾氟沙星對中國圓田螺肝、腎、胃、卵巢以及肌肉5種組織器官的藥物代謝Ⅰ相酶氨基比林-N-脫甲基酶活性的影響[3]，以期探討諾氟沙星對中國圓田螺代謝的影響，為評價水產品對人類健康的安全性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

中國圓田螺取自河北白洋淀，平均質量(5.89±1.75) g，殼高(31.40±5.08) mm，殼寬(18.81±1.88) mm，試驗前中國圓田螺暫養3 d，以適應試驗環境。取12個2 L白瓷缸，每個缸放入經高錳酸鉀溶液消毒過的細沙200 g，同時加入根據文獻[4]中諾氟沙星的環境含量范圍配制的諾氟沙星母液，按諾氟沙星與沉積物(細沙)質量比分別為0 μg/g(空白對照組)、500 μg/g(低含量組)、1000 μg/g(中含量組)、1500 μg/g(高含量組)配制，每組3個平行。沿缸壁加曝氣水至150 mL，將其靜止24 h后，每個缸內加入中國圓田螺10只。試驗過程中，水溫(23±1) ℃，pH 7.0～7.2，溶解氧10.1～10.3 mg/L。在試驗的第2、4、6、8、10 d分別測定各組螺肝、腎、胃、卵巢、肌肉5個組織中的氨基比林-N-脫甲基酶活力。測定各組螺肝、腎、胃、卵巢、肌肉5個組織中氨基比林-N-脫甲基酶活力時，各采3只螺(即每個平行取1只)，作為平行樣本，以減少誤差。解剖中國圓田螺，分別在肝、腎、胃、卵巢、肌肉等部位用解剖針和剪刀取10 μg組織，放入研缽中(4 ℃預冷)，加入990 μL蒸餾水[5]，研碎，制成1∶100(m/V)的組織勻漿，吸入1.5 mL離心管，4 ℃，3000 r/min離心10 min，取上清液。試驗用酶標儀(普朗醫療器械公司)，諾氟沙星純度高于98%(天津市化學試劑一廠)，氨基比林-N-脫甲基酶測定試劑盒(上海滬尚生物科技有限公司)。試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附測定法。

1.2 氨基比林-N-脫甲基酶活力測定

氨基比林-N-脫甲基酶活性的酶聯免疫吸附法測定：加樣參照表1。用封板膜封住反應孔，37 ℃恒溫箱溫育60 min，棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜止1 min，甩去洗滌液，吸水紙上排干，重復洗板5次(表1)。15 min內，在450 nm波長處測定各孔OD值(表2)。

表 1 氨基比林-N-脫甲基酶活力測定試劑盒加樣量及測定過程 μL

表2 不同含量標準品的OD值

氨基比林-N-脫甲基酶標準曲線的制定：根據表2操作測得120、60、30、15、7.5、0 U/L標準品的OD值。在Excel工作表中，以標準品含量作為橫坐標，對應OD值為縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線(圖1)。

圖1 氨基比林-N-脫甲基酶標準品曲線

1.3 數據處理

試驗結果為3次測定值的平均值，數據誤差線為標準誤差，采用SPSS 13.0統計軟件對數據進行單因素方差分析，P<0.05表示處理組與對照組差異顯著，用*表示。

2 結 果

2.1 肝臟組織氨基比林-N-脫甲基酶的測定結果

中國圓田螺肝臟組織氨基比林-N-脫甲基酶活性的變化見圖2。由圖2可知，除低含量組(500 μg/g)第4、6 d和8 d外，其他試驗組均表現出顯著性差異，暴露第2 d時氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著升高；第4 d時低含量組無顯著差異，中含量組(1000 μg/g)氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著上升，高含量組(1500 μg/g)氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著下降；第6、8 d時，低含量組氨基比林-N-脫甲基酶活性無顯著變化，中、高含量組活性顯著下降；第10 d時，低含量組氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著上升，另外兩試驗組氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著下降。這種變化表明，低含量諾氟沙星處理前期誘導肝臟組織氨基比林-N-脫甲基酶活性，中期影響不大；而中、高含量諾氟沙星在處理前期誘導氨基比林-N-脫甲基酶活性，后期表現為抑制，含量越高誘導作用持續時間越短。

圖2 中華圓田螺肝臟組織氨基比林-N-脫甲基酶活性變化*表示與對照組比較有顯著性差異(P<0.05).余同.

2.2 腎臟組織氨基比林-N-脫甲基酶的測定結果

中國圓田螺腎臟組織氨基比林-N-脫甲基酶活性變化見圖3。由圖3可知，低含量諾氟沙星暴露組第4 d時，中國圓田螺腎中氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著上升，第8 d時，氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著下降，其余時間段無顯著影響。中含量諾氟沙星組除第8 d 氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著受抑制外，其余時間均為顯著誘導。高含量諾氟沙星組暴露第2 d和6 d時氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著升高，其余時間則顯著下降。這表示低含量諾氟沙星組腎臟組織氨基比林-N-脫甲基酶活性作用表現為先誘導后抑制；中含量諾氟沙星組影響的總趨勢為抑制作用；而高含量諾氟沙星組的作用與低含量組相似，呈先誘導后抑制。

2.3 胃組織氨基比林-N-脫甲基酶的測定結果

諾氟沙星對中國圓田螺胃組織氨基比林-N-脫甲基酶活性的影響見圖4。由圖4可知，暴露第2 d時，低含量組氨基比林-N-脫甲基酶活性上升，其余組氨基比林-N-脫甲基酶活性下降；第4 d時，低、中含量組酶活性上升，高含量組顯著下降；第6 d時，低、中含量組氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著下降，高含量組無明顯變化，第8 d時，各含量組酶活性達到峰值，各試驗組中氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著下降；第10 d時，試驗組氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著高于對照組, 表明低含量諾氟沙星對胃組織氨基比林-N-脫甲基酶活性的作用為先誘導后抑制，高、中含量組對氨基比林-N-脫甲基酶活性的作用為抑制。

圖3 中國圓田螺腎臟組織氨基比林-N-脫甲基酶活性變化

圖4 中國圓田螺胃組織氨基比林-N-脫甲基酶活性變化

2.4 卵巢組織中氨基比林-N-脫甲基酶活性的測定結果

諾氟沙星對中國圓田螺卵巢組織中氨基比林-N-脫甲基酶的活性變化見圖5。由圖5可知，低含量諾氟沙星組在暴露第2、4、10 d時，氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著下降，第6、8 d時氨基比林-N-脫甲基酶含量顯著高于對照組；中含量諾氟沙星組處理第2 d氨基比林-N-脫甲基酶活性無顯著變化；第4 d酶活性顯著上升，其余時間顯著下降；高含量組除第10 d酶活性的受限制程度高于對照組，其他時間均顯著低于對照組，表明諾氟沙星對氨基比林-N-脫甲基酶活性均表現為抑制作用。

圖5 中國圓田螺卵巢組織氨基比林-N-脫甲基酶活性變化

2.5 肌肉組織氨基比林-N-脫甲基酶的測定結果

諾氟沙星對中國圓田螺肌肉組織中氨基比林-N-脫甲基酶活性的影響見圖6。由圖6可知，第2、4 d時各個試驗組氨基比林-N-脫甲基酶活性均低于對照組。第6、8 d時低含量組肌肉組織氨基比林-N-脫甲基酶活性無明顯影響，中含量組在第6 d時氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著高于對照組，第8 d時低于對照組；高含量組則相反；第10 d時，低、中含量組氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著低于對照組，高含量組則高于對照組。這表明諾氟沙星對肌肉組織氨基比林-N-脫甲基酶活性的作用為抑制作用。

3 討 論

低含量短時間的暴露處理使中國圓田螺肝臟中的氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著升高，對氨基比林-N-脫甲基酶表現出誘導作用，這與Li 等[5]的試驗研究結果相似，而接下來的幾天與對照組沒有顯著性差異，這與其他研究結果不太一致，可能是由于中國圓田螺的機體適應能力所致；當暴露第10 d時酶的活性顯著上升，說明低含量的諾氟沙星可使中國圓田螺氨基比林-N-脫甲基酶活性升高，進而使其有更高的藥物代謝功能；中含量與高含量的諾氟沙星暴露試驗過程中分別在第6 d和第4 d以后顯示出對氨基比林-N-脫甲基酶的抑制作用，這種結果說明諾氟沙星對中國圓田螺肝臟組織氨基比林-N-脫甲基酶活性具有抑制作用，且這種抑制作用存在一定的時間和劑量效應, 這可能與藥物含量高、暴露時間長, 藥物在中國圓田螺體內的殘留時間較長有關。

腎臟是生物的排毒器官，對藥物的排泄起重要的作用。本試驗結果表明，中、高含量組處理下中國圓田螺腎臟組織氨基比林-N-脫甲基酶活性先升后降再上升。初步認為，由于天氣較熱，暴露環境中容易滋生細菌，對中國圓田螺的生長有很大的負面影響，諾氟沙星的殺菌作用有利于試驗組螺的存活，因此在暴露前期對照組酶活性低于這兩組的酶活。在試驗后期高含量組螺肝臟組織氨基比林-N-脫甲基酶活性低于空白組，說明藥物積累對中國圓田螺肝臟氨基比林-N-脫甲基酶的活性的負面影響，甚至比細菌的危害還要大。

在諾氟沙星的作用下，胃組織氨基比林-N-脫甲基酶的活性呈現出不規律的波動趨勢，總的趨勢還是先誘導后抑制，其原因可能是胃食物中的諾氟沙星對胃壁產生了影響，由于個體差異，每一只中國圓田螺的胃中的食物不可能完全一致，因此產生波動的趨勢，說明胃組織不適合作為藥物殘留或者酶活測定的指標。

在諾氟沙星的作用下，卵巢的氨基比林-N-脫甲基酶活性全都表現出抑制的效應。試驗時期為中國圓田螺的繁殖期，這個時期卵巢非常敏感，因此盡管在低含量作用前期，其氨基比林-N-脫甲基酶活性也是被抑制的狀態。

在諾氟沙星作用下，肌肉中氨基比林-N-脫甲基酶活性的變化趨勢與卵巢一樣，其原因可能是中國圓田螺的足直接與沉積物中的藥物接觸，諾氟沙星直接并快速對肌肉起作用，快速在肌肉中蓄積。

4 結 論

本試驗中，處理前期，各含量諾氟沙星對肝臟組織氨基比林-N-脫甲基酶活性有誘導作用，隨含量升高，藥物的誘導作用持續時間變短，誘導力度減小，后期則呈現抑制作用。在腎臟和胃組織中，低含量諾氟沙星對氨基比林-N-脫甲基酶活性先誘導后抑制，而中高含量對氨基比林-N-脫甲基酶為抑制作用。各含量諾氟沙星對敏感卵巢或直接接觸的肌肉氨基比林-N-脫甲基酶有抑制作用，含量越高抑制程度越大，但對中國圓田螺無明顯的致死效應。低含量的諾氟沙星對中國圓田螺氨基比林-N-脫甲基酶活性有顯著誘導作用，可以有效降解其他毒性物質，含量較高時不僅不能促進解毒作用，甚至可能會因為抑制氨基比林-N-脫甲基酶活性而使其對其他藥物的抗性降低，并沿著食物鏈進入人的生產生活中。因此，必須重視諾氟沙星以及其他抗生素的污染，及時有效治理。

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EffectsofNorfloxacinonActivityofEnzymeAminopyrineN-Demethylase(APND)inSnailCipangopaludinachinensis

WANG Hongwei1, YANG Likun1, ZHAO Wenbo1, LI Linfeng1，XING Qingchao1，XIE Henghui2

( 1. College of Life Sciences,Hebei University, Baoding 071002, China；2. Middle School No. 1 at Yang Village, Wuqing District, Tianjin Municipality，Tianjin 300000，China )

The effects of norfloxacin blended in sediments on activity of aminopyrine N-demethylase(APND) were studied in different tissues of snailCipangopaludinachinensisin simulation. The results showed that different concentrations of sedimentary norfloxacin had different influence on the activity of the enzyme. For example，there were increase tendency in activities of enzyme in liver, kidney and stomach at the beginning of the experiment at low concentrations，and then decrease tendency, while the activities of enzyme in kidney and stomach were inhibited at middle and high concentrations of sedimentary norfloxacin. The activities of enzyme were shown to be declined in muscle and ovary.

Cipangopaludinachinensis；norfloxacin；aminopyrine-N-demethylase (APND)

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.04.020

S966.281

A

1003-1111(2017)04-0519-05

2016-07-08；

2016-09-12.

國家自然科學基金聯合資助項目(U1133005)；教育部留學回國基金資助項目(2014-2016)；河北省高層次人才項目(C2015003034)； 河北省自然科學基金資助項目(D2013201105)；河北省重點實驗室運行補助費資助項目(14967611D)；河北省生物學強勢特色學科建設項目(2016)；生物學河北省國家重點學科培育項目(2016)；河北大學中西部高校提升綜合實力工程項目(2016)；河北大學2016年國家級創新創業訓練計劃項目(201610075014)；河北大學2016年研究生創新項目(X2016072)；河北大學2016年校級創新創業訓練計劃項目(2016084); 河北大學2016年實驗室開放項目(sy201662).

王宏偉(1970—)，女，教授，碩士生導師，博士；研究方向：水生生物學. E-mail：13722283189@126.com.