[Gly14]-Humanin對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后炎癥反應及細胞凋亡的影響

余智 顧蘇兵 于民 邵曉莉 洪小琴 姜慧華 吳燕飛

[Gly14]-Humanin對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后炎癥反應及細胞凋亡的影響

余智 顧蘇兵 于民 邵曉莉 洪小琴 姜慧華 吳燕飛

目的 探討Humanin衍生物（[Gly14]-Humanin，HNG）預處理對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后炎癥反應、細胞凋亡的影響及其機制。方法 將96只健康雄性SD大鼠按隨機數字法分為HNG組、生理鹽水組、模型組及假手術組，每組24只。采用改良的Zea-longa線栓法制備大腦中動脈缺血再灌注損傷模型，HNG組大鼠術前5 d給予HNG（2 μl/kg），生理鹽水組與假手術組大鼠予0.9%氯化鈉溶液（2 ml/kg）,均為股靜脈注射，1次/d；模型組不作處理。各組大鼠在再灌注24 h后進行神經功能缺損評分（NDS），采用ELISA法測定大鼠腦組織核因子-κB p65（NF-κB p65）及干擾素-γ（IFN-γ）水平，原位末端標記染色觀察凋亡細胞數及尼氏染色檢測健存神經細胞數。結果 HNG組、生理鹽水組、模型組及假手術組NDS分別為1.5（1.0,2.0）分、3.0（2.0,3.0）分、3.0（2.0,3.0）分和0.0（0.0,0.0）分，假手術組NDS低于另外3組，HNG組NDS低于模型組和生理鹽水組（均P＜0.05）。與假手術組比較，HNG組、生理鹽水組及模型組大鼠的NF-κB p65水平[（13.48±0.85）、（22.15±0.96）、（22.62±0.64）pg/mg]，IFN-γ水平[（5.17±0.67）、（10.83±0.34）、（10.81±0.19）pg/mg]及凋亡細胞的百分率[（48.09±7.62）%、(70.19±8.33）%、（69.02±9.07）%]均較高，不重疊高倍鏡視野中尼氏小體的數量[（10.57±0.51）、（5.16±0.56）和（5.65±0.98）個]較少，差異有統計學意義（P＜0.05）；HNG組大鼠的NDS、NF-κB p65和IFN-γ水平及細胞凋亡率均低于生理鹽水組及模型組，尼氏小體數多于生理鹽水組及模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）；HNG組大鼠IFN-γ與NF-κB p65水平呈正相關（r=0.873，P＜0.01）。結論 [Gly14]-Humanin可抑制腦缺血再灌注損傷過程中的局部炎癥反應、減少細胞的凋亡，從而減輕臨床神經功能的缺損。其機制可能與下調腦組織NF-κB p65的釋放，進一步減少IFN-γ的表達有關。

[Gly14]-Humanin 腦缺血再灌注 核因子-κB p65 干擾素-γ 細胞凋亡

缺血性腦血管病具有較高的發病率、病死率、致殘率及復發率，是目前臨床重點防治的一種疾病。提高患者的療效及改善預后是臨床實踐中迫切需要解決的難題。近年來，炎癥反應在腦缺血再灌注損傷機制中的地位越來越受到關注[1]，既往的實驗研究也已證實，核轉錄因子的表達和炎性細胞的浸潤均參與了腦缺血再灌注損傷過程[2]。新近研究表明，Humanin衍生物（[Gly14]-Humanin，HNG）可通過受體的介導及抗凋亡這兩條途徑發揮對腦外傷神經保護作用，但目前鮮有HNG對腦缺血再灌注影響的報道。本研究通過觀察HNG對腦缺血再灌注大鼠神經功能缺損、炎性因子及細胞凋亡的影響，初步探討HNG對腦缺血再灌注損傷的神經保護作用機制，為缺血性腦血管病的藥物治療提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 大鼠與分組 健康雄性SD大鼠（浙江大學醫學院實驗動物中心提供，SPF級）96只，體重250~300（279.75±18.71）g，按隨機數字法分為 HNG 組、生理鹽水組、模型組及假手術組，每組24只。HNG組、生理鹽水組、模型組大鼠均完成大腦中動脈阻塞造模，假手術組大鼠在術中不插入尼龍線，僅分離左側頸總動脈、頸內動脈及頸外動脈。HNG組大鼠造模前5d給予HNG（2μl/kg），假手術組與生理鹽水組給予0.9%氯化鈉溶液（2 ml/kg），連續 5d股靜脈注射，1次/d；模型組術前不作藥物處理。

1.1.2 藥物、主要試劑與儀器 HNG購自美國R&D Systems公司；核因子-κB p65（NF-κB p65）及干擾素-γ（IFN-γ）ELISA試劑盒購自美國Promega公司；甲苯胺藍、原位末端標記（TUNEL）試劑盒購自美國Sigma公司；酶標儀購自德國Heraeus公司，電子顯微鏡購自日本OLYMPUS公司，Labo fuge 400R高速低溫離心機購自美國BioTek公司等。

1.2 方法

1.2.1 大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型的制備 采用改良的Zea-longa法制備大鼠大腦中動脈阻塞再灌注損傷模型[3]。采用10%水合氯醛（0.35ml/100g）腹腔注射麻醉成功后，仰臥固定在手術臺上，頸部左旁正中切開皮膚約2~3cm，鈍性分離左側頸總動脈、頸內動脈及頸外動脈，避免損傷迷走神經。結扎并游離頸外動脈主干一段，予蛙心夾關閉頸總動脈和頸內動脈后在頸外動脈游離段上剪一小口將進口尼龍魚線栓經頸總動脈分支處通過頸內動脈入顱，深度為（18.0±0.5）mm，使大腦中動脈栓塞并留置1cm左右的線栓頭于體外；缺血4.5h后無需再次麻醉直接外拉尼龍線抽出頸內動脈約20 mm。模型成功判斷標準：大鼠蘇醒后出現左側Horner征，爬行時向右側轉圈或跌倒；提尾懸拉后出現右前肢蜷縮屈曲。剔除標準：術后4.5h之內未蘇醒者；并發蛛網膜下腔出血者；鏡下觀察無缺血病理改變者（觀察的是大鼠缺血側的腦組織，在鏡下未發現明顯凋亡細胞者則說明造模不成功，予以剔除）。造模過程中大鼠死亡或不符合模型要求，予以剔除并隨機補充，模型制備方法同上述，以保證每組樣本量保持在24只。1.2.2 神經功能缺損評分（NDS） 再灌注24h后，采用單盲法行Zea-longa 5分制法對4組大鼠進行計分；（1）0分：無神經功能缺失癥狀，活動正常者；（2）1分：不能完全伸展右前肢；（3）2分：左側Horner征，爬行時向對側轉圈；（4）3分：爬行時身體向右側傾倒；（5）4分：不能自發爬行或意識障礙。

1.2.3 測定腦組織勻漿液NF-κBp65及IFN-γ水平每組分別抽取12只大鼠，于麻醉成功后立即斷頭取腦，切除枕部和額部，于冰上距額葉前端4mm和8mm處進行冠狀分離，取中間4mm厚的腦組織塊，沿矢狀縫兩側約2mm處，從上至下切除兩側半球的正中結構，將左側部分的勻漿液，按照檢測試劑盒說明，采用ELISA檢測勻漿液中NF-κB p65及IFN-γ的含量水平。

1.2.4 觀察凋亡細胞及尼氏小體染色 缺血4.5h再灌注24h后，4組分別取另外12只大鼠行腹腔麻醉，之后以4℃肝素化0.9%氯化鈉溶液對大鼠進行快速心臟灌洗，直到右心房流出的液體變清即可斷頭。然后續用4℃4%多聚甲醛溶液快速灌注固定直到全身僵硬，斷頭取腦固定于10%的甲醛溶液中，常規脫水、透明、浸蠟、包埋，于視交叉處從前至后連續冠狀切片（厚約 2μm），置37℃溫箱內過夜烤干分別進行TUNEL染色和尼氏染色，按照試劑盒檢測步驟進行嚴格操作。TUNEL染色切片在光鏡下（×400）觀察凋亡細胞（胞核出現棕黃染色顆粒），取5個不重復高倍鏡視野（×400），計數凋亡細胞數及細胞總數，計算凋亡細胞率（凋亡細胞數/細胞總數×100%）。尼氏染色切片在光鏡（×400）下以缺血皮層區隨機取5個不重疊高倍鏡視野對尼氏小體的數量進行檢測，計算尼氏小體的數目/相應面積。

1.3 統計學處理 采用SPSS 19.0統計軟件，首先對各組計量資料進行正態性檢驗和方差齊性檢驗，符合正態分布的計量資料以表示，多組間均數比較用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；非正態分布的計量資料以中位數（四分位數間距）表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，兩兩比較采用Nemenyi檢驗；相關性分析采用Pearson直線相關。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4組大鼠NDS的比較 HNG組NDS計1.5（1.0，2.0）分；假手術組大鼠無神經功能缺損，計0.0（0.0，0.0）分；生理鹽水組及模型組均為3.0（2.0，3.0）分。假手術組NDS低于其它3組，HNG組NDS低于生理鹽水組和模型組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

2.2 4組大鼠腦組織NF-κB p65及IFN-γ水平、凋亡細胞率及尼氏小體的比較 見表1。

表1 4組大鼠腦組織NF-κB p65及IFN-γ水平、凋亡細胞率及尼氏小體的比較

由表1可見，與假手術組大鼠比較，HNG組、生理鹽水組及模型組腦組織NF-κB p65及IFN-γ水平、細胞凋亡率均較高，而尼氏小體數較少，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與生理鹽水組及模型組比較，HNG組大鼠的NF-κB p65和IFN-γ水平、細胞凋亡率較低，尼氏小體數較多，差異有統計學意義（P＜0.05）；生理鹽水組與模型組NF-κB p65及IFN-γ含量水平、細胞凋亡率及尼氏小體數差異無統計學意義（P＞0.05）。

此外，光鏡下顯示假手術組大鼠腦組織凋亡細胞很少表達（圖1a），且尼氏小體數目多且體積大，呈紫色均勻分布于核周圍（圖2a）；生理鹽水組和模型組凋亡細胞較多表達（圖1b、c）、體積形態不一，而尼氏小體數目減少，即使存在的尼氏小體亦發生變形或變小（圖2b、c）。HNG組凋亡細胞較生理鹽水組和模型組大鼠減少（圖1d），體積形態亦基本一致，而尼氏小體數目較上述2組均增多且變形較少（圖2d）。

圖1 原位末端標記染色結果（a：HNG組見少量凋亡細胞表達；b、c：生理鹽水組和模型組凋亡細胞明顯增多；d：假手術組未見明顯的凋亡細胞；TUNEL 法，×400）

2.3 HNG組大鼠腦組織NF-κB p65與IFN-γ水平的相關性 HNG組大鼠腦組織IFN-γ與NF-κB p65含量水平呈顯著正相關（r=0.873，P＜0.01）。

3 討論

圖2 尼氏染色結果（a：HNG組尼氏小體較多；b、c：生理鹽水組和模型組尼氏小體數量明顯減少；d：假手術組大鼠腦組織尼氏小體多；Nissl法，×400）

臨床實踐中發現，急性腦缺血后在4.5h內應用重組人組織型纖溶酶原激活物（rt-PA）靜脈溶栓恢復血液灌流時發生再灌注損傷而使神經功能缺損加重，認為再灌注時受血液流變學和缺血缺氧的改變引起神經細胞釋放大量的炎癥介質，促進炎性細胞的聚集和炎性因子的釋放[4]，導致腦缺血損傷區炎性細胞浸潤，加速神經細胞的凋亡。其中炎性細胞的激活和多種炎性因子的級聯反應均參與其中。炎癥反應的要素包括轉錄因子、信號傳導分子、黏附分子和炎癥細胞[5]。目前已知，NF-κB存在于神經細胞、膠質細胞和血管內皮細胞等幾乎所有細胞中，由NF-κB p65與NF-κB p50組成二聚體，而前者亞單位中含有激活轉錄的處理區并能與其他細胞基因啟動子或增強子序列發生特異性結合而促進其轉錄和表達，與炎癥反應、免疫反應以及細胞的分化、增殖和凋亡等密切相關[6]。其中小膠質細胞被缺血激活后，轉變為吞噬細胞，釋放蛋白水解酶、一氧化氮、氧自由基及細胞因子（如 IFN-γ、TNF-α、IFN-α、IL-1及IL-6）的等細胞毒性物質。而IFN-γ作為一種重要的細胞因子，介導周圍組織的細胞毒效應，產生一系列炎癥反應，加重腦缺血損傷。有研究表明，IFN-γ通過活化p38激酶，誘導Ⅱ類組織相容性復合體和細胞因子的表達[7]。

近期大量的體外實驗表明，HNG不僅能有效地抑制多種阿爾茨海默病相關致病因子（如黃素腺嘌呤二核苷酸基因突變及胸膜肺炎放線桿菌抗體等）誘發的神經細胞和非神經細胞的凋亡，還能保護各種應激對細胞的各類損傷，包括I/R誘導的小鼠原代皮質神經細胞凋亡、脂多糖誘導的原代星形膠質細胞炎癥反應等[8]。體內實驗也證明HNG不僅能改善東莨菪堿[9]，二苯乙醇酸及β-淀粉樣肽相關因子誘導的神經記憶功能的損害，還能改善AD轉基因小鼠的學習記憶能力[10-11]。此外，研究還進一步證實HNG除能抵御外傷誘導的神經細胞質膜完整性的破壞抑制顱腦損傷誘導的自噬激活和凋亡，減少腦缺損體積，改善記憶和運動障礙之外[12]，還能改善小鼠大腦中動脈閉塞誘導的急性腦卒中的運動功能并減少損傷側大腦半球的梗死體積[13]。

人們發現通過藥物模擬缺血預處理對腦缺血再灌注損傷產生保護作用，具有較好的臨床應用價值，故備受關注。本研究發現，在腦缺血4.5h再灌注24h后，發現假手術組大鼠無神經功能缺損；生理鹽水組及模型組神經功能缺損癥狀較重，而經HNG預處理的大鼠NDS明顯輕于生理鹽水組及模型組，差異有統計學意義。這表明HNG預處理對改善腦缺血再灌注損傷后的神經功能缺損具有積極意義。

本研究還發現，經HNG預處理的大鼠腦組織NF-κB p65及IFN-γ水平低于生理鹽水組及模型組，差異有統計學意義，生理鹽水組及模型組NF-κB p65及IFN-γ水平的差異無統計學意義；有研究報道，NF-κB可以通過激活細胞因子級聯反應，釋放IFN-γ，導致細胞的凋亡[14]。本研究行相關性分析也發現，HNG組大鼠腦組織NF-κB p65與IFN-γ水平呈正相關。上述結果表明HNG可降低誘發NF-κB p65的釋放，進而減少IFN-γ的水平，從而改善臨床神經功能缺損癥狀。細胞凋亡是由于細胞內外因素激活細胞本身自殺性程序而引起的一種細胞死亡形式，也是一個復雜的生理性調節機制，受到細胞外因子和細胞內基因調控，同時也參與正常細胞的更新及調節細胞分化。從本研究的TUNEL染色和尼氏小體染色結果觀察發現，生理鹽水組及模型組大鼠凋亡細胞較多表達，且尼氏小體數目減少，即使存在的尼氏小體亦發生變形或變小，而經HNG預處理的大鼠缺血半暗帶中細胞凋亡數明顯減少而尼氏小體數量增多，差異有統計學意義。表明HNG具有延緩或阻止缺血再灌注損傷后神經細胞的凋亡，相應的健存的神經細胞數目增多，這對腦缺血再灌注損傷的防治具有重要的意義。

綜合上述研究結果，HNG預處理可減少腦缺血再灌注損傷過程中的神經細胞的凋亡，從而改善神經功能缺損程度，其機制可能與HNG下調腦組織中NF-κB p65的水平，進一步減少促炎介質的釋放有關，這為其在缺血性腦血管疾病治療中的應用提供一定的理論參考。本研究未對不同劑量的HNG療效進行觀察，有待在今后作進一步比較。

[1]Moraga A,Pradillo J M,García-Culebras A,et al.Aging increases microglial proliferation,delays cell migration,and decreases cortical neurogenesis after focal cerebral ischemia[J].J Neuroinflammation,2015,12(1):87.doi:10.1186/s12974-015-0314-8.

[2]余智,劉開祥,廖小明,等.吡格列酮對腦缺血再灌注損傷大鼠的神經保護作用及其機制的研究[J].臨床神經病學,2013,26(2):44-46.

[3]Longa E Z,Weinstein P R,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(5):84.doi:org/10.1161/01.STR.20.1.84.

[4]Deng J,Wu G,Yang C,et al.Rsuvastatin attenuates contrast-in-duced nephropathy through modulation of nitric oxide,Inflammatory responses,oxidative stress and apoptosis in diabetic male rats[J].J Transl Med,2015,13(1):53.doi:org/10.1186/s12967-015-0416-1.

[5]Wang Q,Tang X N,Yenari M A.The inflarnrnatory response in stroke[J].Neuroinllnunol,2007,184(l-2):53-56.doi:org/10.1016/j.jneuroim.2007.11.014.

[6]Ridder D A,Schwaninger M.NF-κB signaling in cerebral ischemia[J].Neuroscience,2009,158(3):995-1006.doi:org/10.1016/j.neuroscience.2009.07.007.

[7]Tham E L,MescherM F.Signaling alterations in activation-induced nonresponsive CD8+T cells[J].Immunol,2001,167(4):2040-2048.doi:org/10.4049/jimmunol.167.4.2040.

[8]Kaur N,Dhiman M,Perez-Polo J R,et al.Ginkgolide B revamps neuroprotective role of apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 and mitochondrial oxidative phosphorylation against Abeta-induced neurotoxicity in human neuroblastoma cells[J].J Neurosci Res,2015,93(14):938-947.doi:10.1002/jnr.23565.

[9]Matsuoka M.Humanin signal for Alzheimer's disease[J].J Alzheimers Dis,2011,24(2):27-32.doi:10.3233/JAD-2011-102076.

[10]Haiyan Xu,Min Cai,Xuedong Zhang.Effect of the blockade of the IL-23-Th17-IL-17A pathway on streptozotocin-induced diabetic retinopathy in rats[J].Graefe's Archive for Clinicaland ExperimentalOphthalmology,2015,253(9):1485-1492.doi:org/10.1007/s00417-014-2842-9.

[11]Sisi Sun,Xiyao Chen,Yang Gao,et al.Mn-SOD upregulation by electroacupuncture attenuates ischemic oxidative damage via CB1R-Mediated STAT3 Phosphorylation[J].Molecular Neurobiology,2016,53(1):331-343.doi:org/10.1007/s12035-014-8971-7.

[12]靳輝,胡海濤,王唯析.[Gyl14]-Humanin對Aβ_(25-35)誘導PC12細胞凋亡的影響[J].細胞與分子免疫學雜志,2010,11(5):427-430.doi:10.13423/j.cnki.cjcmi.005525.

[13]Jin H,Liu T,Wang W X,et al.Protective effects of[Gly14]-Humanin on beta-amyloid-induced PC12 celldeath by preventing mitochondrial dysfunction[J].Neurochem Int,2010,56:417-4 23.doi:org/10.1016/j.neuint.2010.11.015.

[14]劉麗,李世大,趙麗燕.膈下逐瘀沖劑對輸卵管炎性不孕大鼠NF-κB、IFN-γ蛋白表達的影響[J].世界中西醫結合雜志,2014,9(3):251-253.doi:10.13935/j.cnki.sjzx.2014.03.033.

Effect of [Gly14]-Humanin on inflammation and cell apoptotic in brain tissue after focal cerebral ischemia-reperfusion in rats

YU Zhi,GU Subing,YU Min,et al.Department of Rehabilitation Medicine,the First People's Hospital of Chun'an County,Hangzhou 311700,China

Objective To investigate the effect of[Gly14]-Humanin(HNG)on inflammation and cell apoptosis in brain tissue after focal cerebral ischemia-reperfusion injury in rats. Methods Ninety-six male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham-operation group,model group,normal saline (NS)group and HNG group with 24 rats in each group.The ischemia-reperfusion model was induced by middle cerebral artery occlusion(MCAO)with Zea-longa suture embolism method in rats.HNG (2μl/kg)or normal saline (2ml/kg)were given to rats in HNG and NS group 5 days before operation (i.v.qd x5),respectively.After 4.5h of cerebral ischemia and 24h of reperfusion,neurological deficit score(NDS)was assessed,the NF-κB p65 and IFN-γ levels in cerebral tissue were measured by ELISA,neuron apoptosis was detected by Nissl and TUNEL staining;the correlation between IFN-γ and NF-κB p65 levels in cerebral tissue was analyzed. Results The median NDS values in HNG,NS,model and sham-operation groups were 1.5(1.0,2.0),3.0(2.0,3.0),3.0(2.0,3.0)and 0.0(0.0,0.0),respectively;the NDS of sham-operation group was significantly lower than those of other three groups,the NDS of HNG group was significantly lower than that of model group and normal saline group(all P＜0.05).Compared with sham-operation group,the levels of NF-κB p65in HNG group,normal saline group and model group (13.48±0.85,22.15±0.96 and 22.62±0.64pg/mg),the levels of IFN-γ（5.17±0.67,10.83±0.34 and10.81±0.19pg/mg),the ratio of apoptotic neurocyte(48.09±7.62,70.19±8.33 and 69.02±9.07)were significantly increased,and the number of neurons(10.57±0.51,5.16±0.56 and 5.65±0.98)was significantly decreased(all P＜0.05).The NDS,NF-κB p65 and IFN-γ levels,ratio of apoptotic neurocytes in HNG group were significantly lower than those in NS group and model group;while the number of neurons was significantly higher than that in normal saline group and model group(all P＜0.05).The levels of IFN-γ was positively correlated with NF-κB p65 in HNG group (r=0.873,P＜0.01).Conclusion [Gly14]-Humanin can alleviate the inflammation and neuron apoptosis in brain tissue and mitigate the neurologic deficit after focal cerebral ischemia reperfusion injury,which may be associated with down-regulating NF-κB p65 and reducing IFN-γ levels.

[Gly14]-Humanin Cerebral ischemia/reperfusion NF-κB p65 IFN-γ Cell apoptosis

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.20.2016-1561

浙江省醫藥衛生科技項目（201482575）；杭州市科技發展計劃項目（20140633B66）

311700 淳安縣第一人民醫院康復醫學科（余智），神經內科（邵曉莉、洪小琴、姜慧華、吳燕飛）；浙江省人民醫院神經內科（顧蘇兵、于民）

余智，E-mail：wjy001982@163.com

2016-10-05）

楊麗）