副豬嗜血桿菌的分離與鑒定

皮斌/河南省正陽縣獸藥飼料質量檢驗監測中心

張三軍/河南省駐馬店市動物疫病預防控制中心

副豬嗜血桿菌的分離與鑒定

王艷 /河南省駐馬店市動物疫病預防控制中心

皮斌/河南省正陽縣獸藥飼料質量檢驗監測中心

張三軍/河南省駐馬店市動物疫病預防控制中心

副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis，Hps)于1910年由Glasser首次報道，以纖維素性多發性漿膜炎、關節炎和腦膜炎為特征，該病又稱為革拉氏病(Glasser’S disease)，本菌是常規飼養豬群上呼吸道的一種常在菌，但在特定條件下它可以侵入動物機體并引起嚴重的全身性疾病，可以影響2月齡～4月齡的豬，常見于4周齡～8周齡，發病率和死亡率均很高，本菌作為豬呼吸道病綜合征的主要繼發細菌性病原，近年來引起的發病率越來越高，特別是在繁殖呼吸綜合征病毒和圓環病毒2型感染后，幾乎總是伴隨著Hps的感染。副豬嗜血桿菌的血清型在1992年就報道有15種之多，各國各地方流行的血清型也不盡相同，且各型之間缺乏交叉保護，因此，為了了解河南南部Hps的流行狀況和血清型分布特點，本試驗對豫南某豬場的Hps可疑病料進行了分離和鑒定，從而為下一步研究河南省Hps的血清分型方法、疫苗開發奠定基礎。

一、材料與方法

（一）材料

1.試驗地點、時間。本試驗于2016年3月至2017年9月間在河南省駐馬店市動物疫病預防控制中心實驗室進行。

2.病料。取Hps可疑病豬的肺臟、心血、胸腹腔積水、心包積液、關節積液。

3.培養基及主要試劑。NAD，購自中國醫藥(集團)上海化學試劑公司；鮮血培養基和巧克力培養基購于鄭州安圖綠科生物工程有限公司；麥康凱培養基和普通瓊脂培養基為自制；微量生化鑒定試劑購自杭州天和微生物試劑有限公司；藥敏紙片購自北京天壇生物科技公司；金黃色葡萄球菌借自河南出入境檢驗檢疫局技術中心微生物實驗室。

（二）方法

1.直接涂片鏡檢。無菌采集病豬的肺臟、心血、胸腹腔積水、心包積液、關節積液直接涂片，干燥固定后分別進行革蘭氏染色，鏡檢。

2.分離培養及培養特性觀察。將疑似HPS感染的豬肺臟、關節液分別接種于含NAD的鮮血培養基上，置于體積分數為5%的CO2培養箱中，37℃培養24～48 h后，挑取可疑菌落進行革蘭氏染色，鏡檢。接著將可疑菌落分別接種于麥康凱培養基、普通瓊脂培養基、巧克力培養基、普通血平板、含NAD的鮮血培養基上，置于CO2培養箱37℃培養24 h，觀察可疑菌株的生長特性。為盡可能排除雜菌干擾，此時可采用格盤法，挑取在巧克力培養基和含NAD的鮮血培養基上生長良好的可疑菌落，在同樣的位置分別接種于含NAD的鮮血培養基、巧克力培養基和麥康凱培養基、普通瓊脂培養基、普通血平板上，置于體積分數為5%的CO2培養箱中，37℃培養24 h后再次觀察分離菌株的生長特性。

3.衛星現象檢查。衛星現象檢查實驗參考 陸承平的獸醫微生物學進行的。取兩個巧克力培養基的平皿，一個劃線接種所分離純化的細菌并點種金黃色葡萄球菌，另一個只劃線接種分離菌做對照。然后于體積分數為5%的CO2培養箱中37℃培養48 h，觀察其是否在金黃色葡萄球菌周圍長出“衛星現象”。

4.生化試驗鑒定。吸取5μl 0.07%過濾除菌的NAD分別無菌加入到脲酶、氧化酶、接觸酶、吲哚、葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖和核糖等生化管內，并分別挑取疑似Hps的單個菌落穿刺接種，各接種1管，用石蠟膜封口，放入含體積分數為5%的CO2培養箱中37℃培養3 d后觀察。

5.小鼠毒力試驗。用已滅菌的注射器吸取1 ml生理鹽水，噴灑在可疑菌Hps生長良好的NAD的鮮血培養基上，將可疑菌落洗刮下來制成細菌懸液，分別于腹部皮下接種5只健康成年小白鼠，每只0.2 ml，觀察小白鼠的生長情況。

6.藥敏試驗。藥敏試驗采用紙片法進行。挑取2～3個可疑菌落劃線于含NAD的鮮血培養基上，然后吸取3～5滴生理鹽水進行涂布均勻，再把圓形的藥敏紙片按一定的比例貼在其上面，置37℃的CO2培養箱中培養48 h，觀察結果。

二、結果與分析

1.直接涂片鏡檢結果

對不同組織部位所取的病料，經直接涂片，革蘭氏染色后，在油鏡下觀察，可見到革蘭氏陰性細小桿菌，不形成芽孢，未見鞭毛和莢膜。所查組織中以肺臟和關節液中的細菌最密集。

2.分離培養結果

經過5%CO2培養36 h后，發現在含NAD的鮮血培養基上生長良好，可見到有針尖大小，圓形邊緣整齊、灰白色、半明的小菌落生長。挑取這樣的小菌落進行染色鏡檢后可見到革蘭陰性的小桿菌。如圖1所示，以長而彎曲如長絲狀者居多，也有纖細桿狀，間有些球桿狀，表現出明顯的多形性，不形成芽孢，未見莢膜和鞭毛。通過格盤法檢查的結果表明，在37℃5%的CO2條件下培養24 h后，在含NAD的鮮血培養基上生長良好，在巧克力培養基上生長稀少，而在麥康凱培養、普通瓊脂培養基、普通血平板上不生長。分離培養分離菌的結果符合理論上Hps的培養特性。

圖1 分離菌鏡檢結果（革蘭氏染色 1000×）

3.衛星試驗結果

衛星試驗結果表明，在金黃色葡萄球菌的兩側有針尖大小、圓形、邊緣整齊的菌落生長，距金黃色葡萄球菌愈近，菌落愈大，愈遠則菌落愈小，呈現出明顯的“衛星現象”；而在未接種金黃色葡萄球菌的另一個巧克力平皿上則生長不良，菌落稀少，無“衛星現象”出現。

4.生化試驗結果

挑取可疑菌落，接種加入了NAD的生化管中，生化試驗結果見表1。

表1 分離菌生化試驗結果

由表1可知，分離菌發酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖，不發酵核糖；氧化酶、尿酶、吲哚試驗結果為陰性，接觸酶為陽性。該分離菌的生化試驗結果基本和理論上Hps的相一致，說明該分離菌為Hps。

5.小鼠毒力試驗結果

分離菌接種小白鼠后，16～36 h內小白鼠全部死亡，分別無菌取小白鼠的心血、肝、肺、氣管病料接種于NAD的鮮血培養基上，37℃5%CO2條件下培養48 h，在肺、氣管接種的NAD鮮血培養基上分離到疑似的副豬嗜血桿菌菌落，涂片鏡檢出現和患病豬體內相似的革蘭氏陰性細小桿菌。

6.藥敏試驗結果

藥敏試驗結果見表2。

根據中華人民共和國衛生行業標準，紙片法抗菌藥物敏感試驗標準（Kirby-Bauer Method），對藥敏試驗結果進行判斷，Kirby-Bauer Method未建議使用的藥物，僅報告其抑菌圈直徑，不做敏感性分析。從表2可看出，分離菌株對環丙沙星、頭孢他啶、頭孢噻唑、慶大霉素均敏感，對林克霉素、土霉素、四環素均耐藥，而對恩諾沙星為中度敏感型藥物。對諾氟沙星不做敏感分析。通過藥敏試驗，可根據敏感的藥物對相應發病豬場進行藥物治療，臨床用藥應在藥敏試驗結果指導下進行。

表2 分離菌藥敏試驗結果

三、討論

1.Hps的發病原因及預防要點

副豬嗜血桿菌通常只感染豬，可以影響2周齡～4月齡的青年豬，主要在斷奶后和保育階段發病，常見于5～8周齡的豬，發病率一般在10%～15%，嚴重時病死率可達50%。但我國對Hps的研究還不夠系統深入，重視程度不夠。該病多發于春冬氣候驟變季節，長途運輸、飼料更替、斷奶、飼養密度過大、圈舍潮濕等應激因素是其主要誘因。因此宜對該病采取綜合防治措施：加強飼養管理，盡量減少各種應激，實行全進全出制度，防止不同年齡的豬只混養等。目前疫苗免疫是預防Hps最有效的方法之一，在一些地方應用自家苗預防Hps感染，也取得了很好效果。副豬嗜血桿菌的臨床癥狀、剖檢病變和流行病學特征與豬的鏈球菌病、支原體肺炎、傳染性胸膜肺炎等有相似之處，臨床上很容易將它們混淆。在診斷時應從流行特點、臨床癥狀、病理變化和實驗室檢查等多方面來綜合分析，以降低該病對養豬業造成的危害。

2.副豬嗜血桿菌難分離的原因及解決辦法

本試驗針對河南某個豬場疑似副豬嗜血桿菌感染病例進行了病原的分離和鑒定，并對分離株進行藥敏試驗，以便為豬場副豬嗜血桿菌病的控制起到一定的指導作用。副豬嗜血桿菌在病料中的分離率比較低，一般患病豬死亡12 h后，在病料中幾乎分離不到，因此需在患豬剖殺或死亡后12 h以內及時進行病原分離。而且副豬嗜血桿菌十分嬌嫩，對營養要求苛刻，其在巧克力培養基上培養36h～48h生長較差，由于副豬嗜血桿菌有較高的培養要求，其生化實驗的關鍵是特殊培養基基質的選擇，或者商品生化反應管的營養改良。血清、NAD等成份的加入可以保證副豬嗜血桿菌的培養成功，但是必須保證加入的成份不改變生化試劑的pH值等生化特性。一般病原分離應采用含NAD的營養豐富的鮮血平板培養基。本試驗在鮮血平板上加入了30μl0.07%的NAD因子，不但沒有改變培養基的理化特性，而且使得可疑菌生長良好，而在未加NAD因子的鮮血培養基上可疑菌不生長，而且該分離菌在巧克力培養基上也很少生長，對培養基的改良顯得十分重要。此外，目前各豬場在實際生產中廣泛使用抗生素，也是副豬嗜血桿菌分離較低的原因之一，因此在日常的疾病預防和診治時，不要盲目用藥，要在藥敏試驗結果的指導下進行用藥。另外副豬嗜血桿菌是豬上呼吸道中的一種常在菌，故評定疾病是否由副豬嗜血桿菌感染引起，最好能從漿膜、心包、腹膜、關節和腦膜等全身各部位采樣送檢，才能進行本菌感染的診斷。

3.對Hps研究的必要性及意義

由于副豬嗜血桿菌存在多個血清型，不同菌株對同一種抗生素的敏感性有很大差異，在藥敏試驗中，可根據高度敏感的藥物對相應發病豬場進行藥物治療，臨床用藥應在分離菌株的藥敏試驗結果指導下進行。血清型的多樣性以及占很大比例的不能分型菌株，也影響了對具有高效交叉保護力疫苗的研制。副豬嗜血桿菌是早期定居菌，血清型有15種之多，其致病力與血清型有關，這就難以通過管理措施來控制其引起的疾病。本試驗通過對副豬嗜血桿菌的相關研究，通過形態學觀察、病原菌分離培養、生化鑒定、動物試驗，分離和鑒定出了副豬嗜血桿菌。詳細說明了副豬嗜血桿菌的特性，為進一步研究副豬嗜血桿菌的抗原特性，疫苗研制、臨床預防、診斷等奠定了基礎，也為下一步確定副豬嗜血桿菌的血清型提供了實驗依據。在我國，由于飼養技術的調整進行不當，以及突發的新的呼吸道綜合征，使得該病日趨流行，危害日漸嚴重。近年來，我國各豬場發生多發性漿膜炎和關節炎的報道屢見不鮮，其中不少病例的病原被初步診斷為副豬嗜血桿菌，但限于試驗條件，很少有人對其進行確切診斷。因此對我國的副豬嗜血桿菌病的流行病學進行調查并確定我國流行的主要血清型已成為時勢所趨。

（略）