中華絨螯蟹微孢子蟲研究進展

劉洪巖，趙彥華，孫夢玲，薛暉

（江蘇省淡水水產研究所，江蘇 南京 210017）

中華絨螯蟹微孢子蟲研究進展

劉洪巖，趙彥華，孫夢玲，薛暉

（江蘇省淡水水產研究所，江蘇 南京 210017）

微孢子蟲是專性細胞內寄生的真核生物，有著廣泛的宿主。中華絨螯蟹微孢子蟲可以引起中華絨螯蟹微孢子蟲病，因此而受到重視。本文簡要綜述了中華絨螯蟹微孢子蟲的生物學特性，檢測方法以及中華絨螯蟹微孢子蟲病的研究現狀，以期為有效防治河蟹微孢子蟲病提供參考。

中華絨螯蟹；微孢子蟲；研究進展

微孢子蟲是很大的一個門類，最開始被認為是寄生蟲，直至2002年才重新被劃分到真菌界[1]。目前發現的小孢子蟲目微孢子蟲有1 200個，分別屬于150個種[2]。在中國，對微孢子蟲的研究主要集中在昆蟲宿主，特別是蠶[3－4]和蜜蜂[5－6]。目前發現，只有少數幾種微孢子蟲，如 Ameson[7]，Nadelspora[8]和 A－belspora[9]是以螃蟹為宿主的。2002年，王文等[10]通過電鏡觀察，確定了江蘇泗洪的螃蟹中含有微孢子蟲，并且確定了微孢子蟲病發病的不同時期的特性以及中華絨螯蟹微孢子蟲肝胰腺寄生的特性。2006年，王文等[11]通過透射電鏡和掃描電鏡進一步分辨出了河蟹微孢子蟲與Partrick 2002年提出的河蟹微孢子蟲的不同，從而建立了一個新的分支。2015年，江蘇省河蟹養殖過程中，肝胰腺的白化病大規模暴發，丁正峰[12]從病蟹中檢測到大量微孢子蟲18s rDNA。

1 河蟹微孢子蟲的生物學特性

1.1 河蟹微孢子蟲的超微結構

河蟹微孢子蟲的形狀為橢圓形，短軸長度為0.8～1.2μm，長軸長度為1.5～1.9μm。孢子壁厚度為130 nm，由低電子密度的孢子內壁和高電子密度的孢子外壁組成，孢子內壁厚度為100～120 nm，孢子外壁厚度為20～30 nm。河蟹微孢子蟲是單核的，核位于極質體和后極泡之間，在細胞中央的位置，由兩到三層內質網極管以及極管包圍。在孢子的前端，有一個鐘形的錨定盤，錨定盤前端有凸起；孢子后端則包含這2～3個后極泡。河蟹微孢子蟲主要特點是：單核，有一個極絲，一個極絲盤復合物，一個極質體以及后極泡形成發芽裝置；極管圈數為7圈。見圖1。

1.2 河蟹微孢子蟲生活史

河蟹微孢子蟲寄生于中華絨螯蟹的肝胰腺細胞內，生活史包括四個階段：裂殖增殖期，孢子增殖期，孢子原細胞期和感染期。第一個時期是從成熟的孢子細胞質由極管進入宿主細胞開始的。孢原質進入宿主細胞以后發育形成橢圓形的裂殖子。接下來就是裂殖增殖期。這個階段，裂殖子在宿主細胞內不斷分裂，形成多個新的裂殖子，并且發育成為成熟的孢子。這兩個時期都是在宿主細胞的細胞質中進行的。成熟的孢子由發芽裝置彈射出，繼續感染新的細胞[13]，見圖2。

圖1 微孢子蟲模式圖[11]

1.2.1 裂殖增殖期 這個時期從微孢子蟲的原生質進入宿主細胞便開始了。原生質的細胞核由單核分裂成為雙核，四核，進而形成多核，這時的細胞是橢圓形的，具有很大的核區。隨后，原生質的質膜內陷，把細胞核包裹起來，形成新的原生質。微孢子蟲的原生質會進行多次這樣的分裂，從而形成多個原生質體。這些原生質體開始排列成蓮花形，隨后，分裂成為4個或者8個新的原生質。這種原生質體繼續發育，在寄生蟲樣空泡中發育成為單層膜包圍的原生質體。這時的原生質體富含游離的核糖體，細胞核為均勻的顆粒狀，質膜周圍富含線粒體。

1.2.2 孢子發生期 這一階段是由裂殖體向孢子母細胞發育的時期。孢子母細胞是成熟的、不再繼續分裂的孢子。孢子母細胞是單核的，由多核的原生質分裂團分裂產生。電子顯微鏡觀察顯示，當裂殖體的質膜外面有一層致密的高電子層時，就發育為成熟的孢子，即孢子母細胞。孢子母細胞和裂殖體相比，細胞質的電子密度也有所增加，因為在孢子母細胞中，有大量的核糖體和內質網形成。

中華絨螯蟹微孢子蟲之所以成為新的一類，是因為與 Endoreticulatus wdelis[14]，E.schuberg[15]，E.bombycis[16-17]and Endoreticulatus sp.Taiwan[18]相比，有著以下三點明顯的不同：①中華絨螯蟹微孢子蟲比較小，（1.0±0.2）μm×（1.7±0.2）μm；②孢子成熟和孢子生殖同時在宿主的細胞質中進行，這與網蟲屬Ocinaralida是不同的，后者表現出不同發育階段的寄生蟲空泡[17]；③中華絨螯蟹微孢子蟲的極絲，核膜，細胞核在早期的孢子發育階段都是可見的，而這些在Endoreticulatus中則是很難發現的。

2 河蟹微孢子蟲的檢測方法

目前，河蟹微孢子蟲還沒有被提純出來，現階段的檢測方法主要集中在組織病理切片和分子檢測手段上面。

2.1 河蟹微孢子蟲的組織病理學切片檢測

HE染色是觀察病理的主要方法，可以直觀的看到微孢子蟲的含量以及對組織的破壞程度。目前主要有馬松三色法和HE染色法兩種[12]。前者可以根據染料滲入程度分辨不同的粒子，后者則是根據嗜酸性和嗜堿性來區分不同粒子的。

2.2 電鏡切片觀察

圖2 河蟹微孢子蟲的生活史[13]

圖3 白化肝胰腺組織化學切片[21]

成熟的河蟹微孢子蟲主要由孢子壁、孢原質、發芽裝置和孢子細胞器等組成。孢子壁厚而堅硬，由3層結構組成，由外向內依次為刺突狀外層孢子外壁、透明薄層孢子內壁和纖維性內層的原生質膜。孢子壁厚度為130 nm，其中，孢子內壁厚度為100～120 nm，孢子外壁厚度為20～30 nm。孢原質的前部是薄膜層疊成的極膜層，孢原質的后部有沿孢子短軸方向稍伸長的孢子。發芽裝置主要由孢子壁內側螺旋狀盤繞的極管、若干疊成片狀的薄膜層、結構相對松散的極膜層和由多層膜包圍成的后極泡構成。孢子細胞質內可見有內質網、極膜層結構、高爾基體和線粒體等細胞器。河蟹微孢子蟲的成熟孢子大小為（1.7±0.2）μm ×（1.0±0.2）μm，呈橢圓形，極管前端與孢子縱軸呈平行狀，后端沿孢子壁與縱軸形成螺旋狀卷曲，極絲的極管圈數一般為7～8 圈，見圖 4。

2.3 常規PCR檢測和熒光PCR檢測

圖4 河蟹微孢子蟲縱軸切面的透射電鏡照片[11]

檢測方法目前采用PCR方法，檢測河蟹微孢子蟲時，主要針對微孢子蟲16sRNA基因來設計特異性引物[19]。丁正峰利用巢式PCR擴增出931 bp的片段，經比對確認為河蟹微孢子蟲18sRNA。

常規PCR的檢測，對于低濃度的微孢子蟲檢出率不高，經過筆者實驗，常規PCR只能檢測到102以上的微孢子蟲。因此，需要更加靈敏的檢測方法。熒光定量PCR滿足了這一需求。熒光定量PCR的檢出線為101，并且能夠確定微孢子蟲的含量，確定微孢子蟲在河蟹體內的分布情況。為微孢子蟲的檢測提供了更加靈敏的方法，也為后續研究提供了一種新途徑。

2.4 原位雜交

原位雜交是指將特定標記的已知順序核酸為探針與細胞或組織切片中核酸進行雜交，從而對特定核酸順序進行精確定量定位的過程。丁正峰[16]設計 了 兩 對 引 物 W3F （50－CTGTGAGGCTATTGTTGGGC－30）and W3R（50－TACTGTGCTCCCTGTCCATT－30），對白化的肝胰腺進行了原位雜交。對比HE染色和直接顯微鏡觀察的結果，原位雜交能夠更加靈敏地顯示出低濃度的微孢子蟲。

3 螃蟹微孢子蟲病

早 在 1970年 ，Sprague就 指 出 ，Ameson michaelis是引起墨西哥灣，亞特蘭大的海蟹肌肉溶解的病因。這種微孢子蟲存在于海蟹的肌肉中，會使螃蟹的肌肉成為棉花樣，并且失去原有的味道，被稱為“棉花蟹”。Ameson michaelis[3]的傳染性很高，但是并沒有引起“棉花蟹”的大規模傳播。

1987年，另外一種螃蟹微孢子蟲被發現。Azevedo發現的這種寄生在岸蟹肝胰腺中的微孢子蟲叫做Abelspora portucalensis，這種微孢子蟲是單核的，以二分式的裂殖方式繁殖的。每個微孢子蟲可以裂殖為兩個，兩個再分為四個，這一過程是在微孢子蟲囊膜中進行的[9]。1994年，Olson等[8]在太平洋大蟹中發現了微孢子蟲Nadelspora canceri。2007年，Stentiford G D.在寄生蟹中發現了微孢子蟲Enterospora[20]。

但是，河蟹微孢子蟲和上述的都不是一種。河蟹微孢子蟲的孢子時期都是單核的，多核的孢子母細胞原生質體以蓮花形式的分裂方式，分為4個或者8個單核孢子，這些孢子在寄生蟲樣的空泡中成熟。這種特征跟內網蟲屬比較相似，因此2007年，王文[11]建立了Endoreticulatus eriocheir sp.nov這一分支。2015年，江蘇暴發了嚴重的河蟹肝胰腺白化病，丁正峰[12]在發病的河蟹肝胰腺中，發現了大量的微孢子蟲，經過18sRNA的鑒定，確認為Endoreticulatus eriocheir sp.nov.。河蟹微孢子蟲病的主要病癥為肝胰腺白化，水化，進而消失，不會引起螃蟹的死亡，但是會嚴重影響螃蟹的品質。

目前，對河蟹微孢子蟲和河蟹肝胰腺白化之間的關系，爭議頗多。2016年，丁正峰[21]利用18sRNA設計引物，對白化的肝胰腺進行的原位雜交，在熒光顯微鏡下，可以看到陽性雜交信號。并且文中還指出，原位雜交能發現組織化學和普通顯微鏡觀察所不能發現的，早期的、含量低的河蟹微孢子蟲，見圖5。

4 結語

河蟹微孢子蟲是一種真核生物，內蟲網屬，生活史包括四個階段：裂殖增殖期，孢子增殖期，孢子原細胞期和感染期。河蟹微孢子蟲為單核，多核的孢子母細胞原生質經過蓮花式的分裂，分裂為4個或者8個孢子。

河蟹微孢子蟲病可以引起河蟹肝胰腺的白化，水化，最終肝胰腺消失，給螃蟹養殖也造成了很大的損失。目前，對于該病的研究集中在檢測方法的建立上，現在已經能夠成熟地利用PCR和熒光PCR檢測河蟹微孢子蟲的含量，用組織化學的方法直觀地檢測到微孢子蟲，但是，對于感染途徑等流行病學調查還沒有相關文獻報道，也沒有特效藥可以治療。

今后，河蟹微孢子蟲病的研究方向應主要集中在傳染途徑的確定以及防治特效藥的研究方面。

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Research progress on the Endoreticulatus eriocheir sp.nov.（Microsporidia，Encephalitozoonidae）

Liu Hongyan，Zhao Yanhua，Sun Mengling，Xue Hui
（Freshwater Fishery Research Institute of Jiangsu Province，Nanjing 210017，China）

Microsporidia are an extremely large and diverse group of microbial eukaryotes and have wide host area.For emerging pathogen in Eriocheir sinensis，more attention had been put in it.In order to provide a reference for controlling microsporidian infection effectively，the structure，detecting technology and progress of studying on the Endoreticulatus eriocheir sp.nov.are reviewed in this paper.

Eriocheir sinensis；microsporidia；research progress

S941.5

A

1004－2091（2017）10－0042－06

10.3969/j.issn.1004－2091.2017.10.009

江蘇省科技計劃現代農業項目（BE2016392）

劉洪巖（1986－），女，研究實習員，主要從事水產病害研究.E－mail：njsfdxliuhongyan@163.com

薛暉（1968－），男，研究員級高級工程師.E－mail：jsxuehui@163.com

圖5 河蟹白化肝胰腺原位雜交

2016-12-26）