白斑綜合征病毒膠體金免疫層析試劑板的研制

劉長(zhǎng)軍 ，王振國(guó) ，陳青舟 ，夏武強(qiáng) ，繆翁晟途 ，平夏婷

（1.象山縣海洋與漁業(yè)質(zhì)量技術(shù)檢測(cè)中心，浙江 寧波 315700；2.杭州南開(kāi)日新生物技術(shù)有限公司，浙江 杭州 311215）

白斑綜合征病毒膠體金免疫層析試劑板的研制

劉長(zhǎng)軍1，王振國(guó)2，陳青舟2，夏武強(qiáng)1，繆翁晟途2，平夏婷2

（1.象山縣海洋與漁業(yè)質(zhì)量技術(shù)檢測(cè)中心，浙江 寧波 315700；2.杭州南開(kāi)日新生物技術(shù)有限公司，浙江 杭州 311215）

將膠體金免疫層析技術(shù)應(yīng)用于對(duì)蝦白斑綜合征的診斷，研制了一種檢測(cè)對(duì)蝦中白斑綜合征病毒的膠體金免疫層析試劑板。將膠體金標(biāo)記的抗白斑綜合征病毒單克隆抗體包被在金標(biāo)墊上，將抗白斑綜合征病毒多克隆抗體和羊抗鼠IgG分別包被在硝酸纖維素膜的檢測(cè)線和質(zhì)控線上。通過(guò)雙抗體夾心法檢測(cè)樣品中白斑綜合征病毒含量。結(jié)果表明，該試劑板對(duì)白斑綜合征病毒的最低檢出限為1.0 mg/kg，特異性好，穩(wěn)定性高，整個(gè)檢測(cè)所需時(shí)間為8～10 min，適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

白斑綜合征病毒；雙抗體夾心法；免疫層析；膠體金

白斑綜合征（White Spot Syndrome，簡(jiǎn)稱 WSS）是由白斑綜合征病毒（White Spot Syndrome Virum，簡(jiǎn)稱WSSV）引起的一種對(duì)蝦嚴(yán)重傳染性疾病，典型癥狀為病蝦頭胸甲內(nèi)側(cè)出現(xiàn)不同大小的白色斑點(diǎn)。該病發(fā)病快、病死率高、傳播速度快、宿主范圍廣，對(duì)對(duì)蝦養(yǎng)殖造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。WSS還被列入了世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）水生動(dòng)物疫病名錄[2]。在2008年我國(guó)農(nóng)業(yè)部第1125號(hào)公告《一、二、三類動(dòng)物疫病病種名錄》中，WSS被劃為一類動(dòng)物疫病[3]。

目前尚未發(fā)現(xiàn)有效的治療WSS的方法，因此發(fā)展快速、靈敏、穩(wěn)定的WSSV檢測(cè)技術(shù)成為科研人員研究的重點(diǎn)。通過(guò)有效的檢測(cè)技術(shù)，對(duì)蝦養(yǎng)殖戶可盡早采取預(yù)防措施，切斷傳播途徑，最大限度地減少生產(chǎn)上的損失。近年來(lái)，WSSV檢測(cè)的方法發(fā)展迅速，主要有：肉眼觀察法，電鏡觀察法，生化檢測(cè)、免疫學(xué)方法，細(xì)胞培養(yǎng)法，分子生物學(xué)法等。Numan等[4]采用巢式PCR進(jìn)行WSSV的引物設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光定量PCR相比靈敏度得到較大的提高，檢出限為1拷貝的WSSV。鄭曉聰?shù)萚5]選用抗WSSV單克隆抗體包被ELISA板，用兔多抗作為捕獲抗體，建立了具有良好特異性和敏感性的雙抗體夾心法用于WSSV的檢測(cè)。張玲[6]研發(fā)的白斑綜合征病毒膠體金免疫層析半定量快速檢測(cè)試紙條將不同類型的WSSV單克隆抗體混合后包被于試紙條檢測(cè)線，用來(lái)檢測(cè)樣本中的WSSV，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該試紙條在WSSV濃度為783 ng/mL～6.26μg/mL范圍內(nèi)可實(shí)現(xiàn)半定量檢測(cè)。研究采用WSSV制備單克隆抗體與多克隆抗體，成功建立了檢測(cè)WSSV的雙抗體夾心法膠體金免疫層析試劑板。相比于現(xiàn)有的檢測(cè)方法，即簡(jiǎn)化了操作流程，又縮短了檢測(cè)時(shí)間，適用于快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。對(duì)實(shí)現(xiàn)病原的快速篩查，病情的防治有很大的促進(jìn)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

對(duì)蝦白斑綜合征病毒（WSSV），傳染性肌肉壞死病毒（Infection Myonecrosis Virus，IMNV）、桃拉綜合征病毒（Taura Syndrome Virus，TSV）、鯉春血癥病毒（Spring Viraemia of Cup Virus，SVCV）、病毒性出血性敗血癥病毒（Viral Haemorrhagic Septicaemia Virus，VHSV）均由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定、保存。家兔、BALB/c小鼠、ICR小鼠購(gòu)自浙江大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0由本實(shí)驗(yàn)室保存。健康對(duì)蝦，10～20 g/尾，購(gòu)于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

1.1.1 試劑

氯金酸 （HAuCl4·4H2O）、聚乙二醇 20000（PEG20000）、聚乙二醇 40000（PEG40000）和羊抗鼠IgG、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購(gòu)于Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基、HAT和HT選擇性培養(yǎng)基購(gòu)于HyClone公司；硝酸纖維素膜（NC）、膠體金結(jié)合墊、樣品墊、吸水墊購(gòu)于Millipore公司。白斑綜合征病毒ELISA試劑盒購(gòu)于北京綠源伯德生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 儀器

BioJet XYZ3000型點(diǎn)膜儀購(gòu)于美國(guó)BioDot公司、Avanti J－26 XP高速冷凍離心機(jī)購(gòu)于美國(guó)Beckman公司、恒溫鼓風(fēng)干燥箱購(gòu)于上海精宏實(shí)業(yè)設(shè)備有限公司、切割機(jī)購(gòu)于杭州市恒通設(shè)備有限公司、78HW－1恒溫磁力攪拌器購(gòu)于杭州儀表電機(jī)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 抗WSSV單克隆抗體制備

1.2.1.1 動(dòng)物免疫 取適量WSSV與弗氏完全佐劑等量混合乳化，皮下注射BALB/c小鼠（抗原蛋白量為100μg/只）。初次免疫兩周后，WSSV與弗氏不完全佐劑混合乳化免疫BALB/c小鼠，免疫方法同上。之后免疫不再加佐劑，分別在第6周及融合前3 d腹腔再加強(qiáng)免疫一次。

1.2.1.2 細(xì)胞融合 先將免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0混合于融合管內(nèi)，1 000 r/min下離心10 min，除去上清液，底層細(xì)胞輕振松散后再置于37℃水浴中預(yù)熱。再向細(xì)胞邊緩慢滴加已預(yù)熱的PEG4000溶液1 mL邊進(jìn)行攪拌，然后緩慢加入不完全DMEM培養(yǎng)基，終止融合。靜置10 min后1 000 r/min下離心10 min，除去上清液，然后加入HAT培養(yǎng)基，使細(xì)胞懸浮并混勻。加入預(yù)先制備的ICR小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞，充分混勻后分裝至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。于6%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至第4～5天每孔各補(bǔ)加1滴HAT培養(yǎng)基，至第9～10天用HT培養(yǎng)基取代HAT培養(yǎng)基，上清液變黃后開(kāi)始檢測(cè)篩選。

1.2.1.3 陽(yáng)性克隆的篩選及建株 用ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清液中的抗WSSV抗體。按常規(guī)方法進(jìn)行，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)并及時(shí)凍存，同時(shí)按有限稀釋法進(jìn)行亞克隆2～3次，直至每孔的陽(yáng)性率為100%時(shí)才可定株[8]。

1.2.1.4 腹水的制備及純化 抗WSSV單克隆抗體細(xì)胞株復(fù)蘇并將其轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)至2×107注入小鼠腹腔內(nèi)（提前一周每只BALB/c健康小鼠腹腔內(nèi)注射0.5 mL無(wú)菌液體石蠟），10～12 d小鼠出現(xiàn)腹部明顯膨大，處死小鼠收集腹水。用60 mM pH 4.2的醋酸鹽緩沖液4倍稀釋，加腹水體積1/10的辛酸，攪拌30 min。12 000 r/min離心20 min取上清液。用1N NaOH調(diào)節(jié)上清液pH值至7.2，加硫酸銨至33%飽和度，12 000 r/min離心20 min，沉淀溶解于0.01 M pH值為7.2的PBS緩沖液中。最后透析除鹽得到抗WSSV單克隆抗體，置－80℃?zhèn)溆肹9]。

1.2.2 WSSV多克隆抗體的制備 采用常量免疫法。調(diào)整WSSV的蛋白濃度，免疫量為1 mg/只，采用相應(yīng)程序共免疫6次。初次免疫后每隔2周加強(qiáng)免疫一次。最后一次免疫后2周，耳靜脈采血，分離血清，用ELISA試劑盒檢測(cè)抗體效價(jià)。效價(jià)達(dá)1∶5 000以上時(shí)，通過(guò)頸動(dòng)脈放血，收集全血，分離血清。用辛酸－飽和硫酸銨法提取IgG，得到抗WSSV多克隆抗體，置－80℃?zhèn)溆肹5]。

1.2.3 金標(biāo)抗體的制備

1.2.3.1 膠體金的制備 將實(shí)驗(yàn)需要的所有玻璃器皿清洗干凈。先用自來(lái)水清洗干凈，然后在重鉻酸鉀洗液中浸泡過(guò)夜，最后依次使用自來(lái)水、蒸餾水、超純水沖洗5次。在56℃烘箱中烘干備用。取0.01%氯金酸溶液100 mL加熱2 min至沸騰，邊攪拌邊加入1%檸檬酸三鈉水溶液1 mL，繼續(xù)煮沸10 min至酒紅色后冷卻，加蒸餾水恢復(fù)到原體積，冷卻后用0.22μm濾膜過(guò)濾雜質(zhì)，4℃保存?zhèn)溆肹10]。

1.2.3.2 膠體金標(biāo)記單克隆抗體 取已制備好的膠體金溶液100 mL，用0.1 mol/L的K2CO3溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0。邊攪拌邊添加抗WSSV單克隆抗體直至膠體金溶液恢復(fù)酒紅色，并在10 min內(nèi)不褪色。共加入抗WSSV單克隆抗體1.5 mg。磁力攪拌器上攪拌20 min，再逐滴加入2 mL 25 g/L PEG20000，攪拌15 min。20 000 r/min離心15 min，除去上清液，用10 mL pH值7.4的PBS緩沖液（含0.4 g/L PEG20000）清洗2次。將沉淀物用5 mL含質(zhì)量濃度為20 g/L BSA的PBS緩沖液（pH值7.4）溶解，過(guò)0.22μm無(wú)菌過(guò)濾器，4℃保存?zhèn)溆肹12]。

1.2.4 試劑板的組裝

將樣品墊（玻璃纖維）用含2%BSA、2.5%蔗糖、1%吐溫－20、0.3%PVP－k30 以及 0.02%NaN3的0.002 mol/L的硼酸溶液緩沖液（pH值7.4）封閉，于37℃溫箱中干燥[11]。用點(diǎn)膜儀將制備好的金標(biāo)抗體噴涂到玻璃纖維上，噴膜量為1μL/cm。立即放入冷凍真空干燥機(jī)中抽干。抗WSSV多克隆抗體和羊抗鼠IgG用 0.01 mol/L PBS（pH 值 7.2）稀釋至 2 mg/mL，用點(diǎn)膜儀分別噴涂在NC膜上作為檢測(cè)線（T線）和質(zhì)控線（C線），噴膜量為1μL/cm。樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊按順序黏貼于PVC背襯上。用切割機(jī)將貼好的板切割成4 mm寬的細(xì)條，裝入塑料模板中制成檢測(cè)試劑板，然后放入帶干燥劑的鋁箔袋中密封。試劑板組成如圖1所示。

圖1 膠體金免疫層析試紙條組成

1.2.5 樣品檢測(cè)操作

取出檢測(cè)試劑板，用滴管吸取待檢樣品溶液，滴加2滴于加樣孔中，加樣后開(kāi)始計(jì)時(shí)：結(jié)果應(yīng)在3～5 min讀取，其他時(shí)間判讀無(wú)效；讀取結(jié)果。若試劑板上T線與C線均顯色，結(jié)果為陽(yáng)性；若試劑板僅C線出現(xiàn)紫紅色而T線未顯色，結(jié)果為陰性；若試劑板上C線與T線均為顯色，結(jié)果無(wú)效，需要重新檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。

圖2 檢測(cè)結(jié)果示意圖

1.2.6 檢出限檢測(cè)

稱取健康對(duì)蝦（PCR檢測(cè)無(wú)WSSV感染）的蝦鰓 2 g，加入 WSSV 溶液至終濃度為 0.25、0.5、0.75、1.0、2.0、4.0 mg/kg，再加入 0.01 M PBS 按 1 ∶10（W/V）的比例混合，加少量石英砂用研缽研磨、勻漿1 min，再沉淀5～10 min，取上清液作為加標(biāo)檢測(cè)樣品，用1.2.4制備的試劑板分別對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，陰性對(duì)照為0.01 mol/L PBS溶液。每組設(shè)6個(gè)平行樣。

1.2.7 特異性檢測(cè)

按照上述方法將 IMNV、TSV、SVCV、VHSV 四種病毒加入健康對(duì)蝦的蝦鰓中配置成加標(biāo)檢測(cè)樣品，陽(yáng)性對(duì)照為WSSV加標(biāo)檢測(cè)樣品，濃度均與1.2.6測(cè)定的檢出限相同。陰性對(duì)照為0.01 mol/L PBS溶液。用1.2.4制備的試劑板分別對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，每組設(shè)6個(gè)平行樣。

1.2.8 試劑板檢測(cè)與ELISA的符合率

取健康對(duì)蝦蝦鰓樣本20份，其中10份加入WSSV制成陽(yáng)性樣本，另外10份加入0.01 mol/L PBS溶液制成陰性樣本。分別使用ELISA試劑盒及試劑板檢測(cè)WSSV的含量比較兩者的符合率。

1.2.9 穩(wěn)定性檢測(cè)

取3個(gè)不同批次的試紙條在20～25℃條件下連續(xù)放置 12 個(gè)月，期間于生產(chǎn)當(dāng)天、1、2、3、6、9、12個(gè)月分別從3個(gè)批次產(chǎn)品中抽取檢測(cè)試劑卡檢測(cè)陽(yáng)性和陰性樣品各50份，測(cè)定檢出限、假陽(yáng)性率和假陰性率。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢出限

將陰性對(duì)照以及WSSV終濃度為0.25、0.50、0.75、1.0、2.0、4.0 mg/kg 的加標(biāo)檢測(cè)樣品，用試劑板進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)試樣做6個(gè)重復(fù)，3～5 min后觀察結(jié)果，檢測(cè)線顏色呈梯度遞增，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。在陰性對(duì)照及WSSV終濃度為0.25、0.50 mg/mL范圍內(nèi)，C線顯色而T線不顯色；0.75 mg/mL濃度下C線顯色，T線條帶模糊；1.0～4.0 mg/kg范圍內(nèi)T線與C線顯紫紅色，條帶清晰。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該試劑板的WSSV檢測(cè)限為1.0 mg/kg。

圖3 膠體金試劑板的檢出限實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 特異性

將 IMNV、TSV、SVCV、VHSV 四種病毒加入健康對(duì)蝦的蝦鰓中配置成1.0 mg/kg加標(biāo)檢測(cè)樣品，用試劑板進(jìn)行測(cè)定，判斷其檢測(cè)的特異性情況。其中陽(yáng)性對(duì)照為終濃度為1.0 mg/kg的WSSV加標(biāo)檢測(cè)樣品，陰性對(duì)照為0.01 mol/L PBS溶液。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。試劑板對(duì)IMNV、TSV、SVCV、VHSV四種病毒反應(yīng)呈陰性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明試劑板對(duì)WSSV具有較高的特異性。

表1 膠體金試劑板特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 符合率

用試劑板對(duì)含不同質(zhì)量濃度的WSSV蝦鰓處理樣品進(jìn)行檢測(cè)并與ELISA的檢測(cè)結(jié)果相比較。共檢測(cè)20份樣品，其中陰性樣品10份，陽(yáng)性樣品10份，部分樣品檢測(cè)結(jié)果如表2所示：在WSSV濃度高于1.0 mg/kg時(shí)，試劑板的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性；在WSSV濃度低于1.0 mg/kg時(shí)，試劑板實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性，均與ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。所以該試劑板的定量檢測(cè)限為1.0 mg/kg。

2.4 試紙條穩(wěn)定性

用同一批次不同檢測(cè)試劑檢測(cè)同一樣品，用不同批次檢測(cè)試劑檢測(cè)同一樣品，其質(zhì)控線、檢測(cè)線的顯色時(shí)間及顏色深淺和最終結(jié)果判斷基本相同。將3個(gè)不同批次的試劑板在20～25℃條件下連續(xù)放置 12 個(gè)月，期間于生產(chǎn)當(dāng)天、1、2、3、6、9、12 個(gè)月分別從3個(gè)批次產(chǎn)品中抽取檢測(cè)試劑卡檢測(cè)陽(yáng)性和陰性樣品各50份，測(cè)定檢出限、假陽(yáng)性率和假陰性率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。在12個(gè)月之內(nèi)，試劑板的檢出限未發(fā)生變化，假陽(yáng)性率和假陰性率在4%以下，為可接受范圍。因此試劑板能在室溫條件下（20～25℃）保存12個(gè)月。

3 結(jié)論與展望

試劑板用于對(duì)蝦蝦鰓中WSSV的檢測(cè)，靈敏度為1.0 mg/kg。具有特異性高、穩(wěn)定性好、檢測(cè)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。可用于對(duì)蝦中WSSV的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，為WSSV的預(yù)防和診斷提供依據(jù)。

表2 膠體金免疫層析試劑板與ELISA檢測(cè)結(jié)果比較

表3 膠體金免疫層析試劑板的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

試劑板的制備基于雙抗體夾心原理。金標(biāo)結(jié)合墊上包被的抗WSSV單克隆抗體與T線上包被的抗WSSV多克隆抗體將樣本中的WSSV分別進(jìn)行固定和截留，最終以T線與C線均顯色作為WSSV存在的判別標(biāo)準(zhǔn)。抗WSSV單克隆抗體與抗WSSV多克隆抗體的分離純化直接影響到最終產(chǎn)品的靈敏度，過(guò)柱是提高抗體純度的方法之一。谷萬(wàn)港[13]在硫酸銨沉淀法的基礎(chǔ)上增加親和層析能親和柱進(jìn)行抗VP28單克隆抗體（抗WSSV單克隆抗體的一種類型）的純化，但該方法會(huì)存在抗體消耗量大的問(wèn)題，因此大批量制備時(shí)要考慮到其中的損益。在膠體金標(biāo)記單克隆抗體的過(guò)程中，膠體金的顆粒大小和標(biāo)記過(guò)程的pH值等均會(huì)對(duì)金標(biāo)抗體的質(zhì)量造成影響。本實(shí)驗(yàn)中采用的膠體金制備方法使膠體金顆粒直徑在40μm，對(duì)于其抗體吸附能力和穩(wěn)定性均能適應(yīng)檢測(cè)的需要。為使膠體金pH值等于單克隆抗體等電點(diǎn)pH值，使膠體金與單克隆抗體結(jié)合最緊密，形成的金標(biāo)抗體最穩(wěn)定，本實(shí)驗(yàn)用0.1 mol/L的K2CO3溶液精確地找到膠體金標(biāo)記單克隆抗體的最佳pH值。但本實(shí)驗(yàn)的適用對(duì)象固定在經(jīng)濟(jì)作物對(duì)蝦，這就意味著對(duì)于其他宿主如蟹類、橈足生物等無(wú)法做到WSSV的準(zhǔn)確檢測(cè)。因此在檢出限的設(shè)置方面可以再進(jìn)行其他樣本的實(shí)驗(yàn)，從而推廣其應(yīng)用范圍。

目前，膠體金免疫層析技術(shù)在毒素檢測(cè)、抗生素檢測(cè)、重金屬檢測(cè)、微生物檢測(cè)、病毒檢測(cè)等領(lǐng)域都有應(yīng)用。定性檢測(cè)向定量檢測(cè)的轉(zhuǎn)化，檢測(cè)儀器的跟進(jìn)加快了膠體金快速檢測(cè)試劑的發(fā)展。操作方便、靈敏、快速等現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方面的優(yōu)點(diǎn)和低成本的特定優(yōu)勢(shì)使其具有商業(yè)化的發(fā)展前景。

[1]Jesús Genaro Sánchez-Martínez，Gabriel Aguirre-Guzmán，Humberto Mejía-Ruíz.White Spot Syndrome Virus in cultured shrimp:A review [J].Aquaculture Research，2007，38（13）:1339-1354.

[2]世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE），國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局譯.水生動(dòng)物疾病診斷手冊(cè)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2000.[3]農(nóng)業(yè)部.農(nóng)業(yè)部1125號(hào)公告:一、二、三類水生動(dòng)物疫病病種名錄[S].北京：農(nóng)業(yè)部，2008.

[4]Numan L M，Lightner D V.Optimized PCR assay for detection of white spot syndrome virus（WSSV）[J].Journal of Virological Methods，2011（171）：318-321.

[5]鄭曉聰，劉葒，張朋，等.對(duì)蝦白斑綜合征病毒雙抗體夾心ELISA 方法的建立[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫，2012，29（4）：41-43.

[6]張玲.白斑綜合征病毒膠體金免疫層析半定量快速檢測(cè)試紙條的研制與應(yīng)用[D].青島：中國(guó)海洋大學(xué)，2015.

[7]Xiaojie Wang，Wenbin Zhan.Development of an immunochromatographic test to detect white spot syndrome virus of shrimp[J].Aquaculture，2006（225）：196-200.

[8]郝貴杰，沈錦玉，徐洋，等.WSSV單克隆抗體的制備及其在紅螯螯蝦病毒病檢測(cè)中的初步應(yīng)用[J].集美大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009（2）：120-125.

[9]王曉潔.對(duì)蝦白斑癥病毒快速檢測(cè)試劑盒的研制及其應(yīng)用[D].青島：中國(guó)海洋大學(xué)，2005.

[10]Nguyen D T，Kim Dong-Joo，Kim Kyo-Seon.Controlled synthesis and biomolecular probe application of gold nanoparticles[J].Micron，2011，42（3）：207-227.

[11]彭伏虎，王政，畢丁仁.H9亞型禽流感病毒膠體金免疫層析快速檢測(cè)試紙條的研制及初步應(yīng)用研究 [A].首屆中國(guó)獸藥大會(huì)——獸醫(yī)生物制品學(xué)、獸醫(yī)微生物學(xué)學(xué)術(shù)論壇論文集[C].北京：中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，2008.

[12]王錢，李康，陳樹(shù)芬，等.膠體金免疫層析法對(duì)組織樣品中磺胺甲惡唑殘留的快速檢測(cè) [J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2009，28（4）：458－461.

[13]谷萬(wàn)港.對(duì)蝦白斑綜合征病毒單克隆抗體的制備和應(yīng)用[D].北京：中國(guó)科學(xué)院研究生院，2006.

廣東湛江出口中國(guó)2017年首批輸澳生蝦

廣東湛江檢驗(yàn)檢疫局2017年9月11日向媒體通報(bào)，中國(guó)2017年首批出口澳大利亞生蝦經(jīng)湛江檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)合格后，目前正由湛江港裝船運(yùn)往澳大利亞。

據(jù)了解，該批生蝦產(chǎn)品共6個(gè)貨柜，由廣東國(guó)美水產(chǎn)食品有限公司生產(chǎn)，重量97.64 t，貨值190.25萬(wàn)美元。

湛江是中國(guó)水產(chǎn)品養(yǎng)殖、加工和出口大市，水產(chǎn)業(yè)形成了完整的產(chǎn)業(yè)鏈，并代表中國(guó)先后通過(guò)了美國(guó)、歐盟、韓國(guó)、日本、俄羅斯等國(guó)家和地區(qū)的水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)控體系的考察評(píng)估，當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖的生蝦、活魚(yú)也實(shí)現(xiàn)了中國(guó)內(nèi)地首次直供香港。

據(jù)介紹，2017年1月初，澳大利亞因國(guó)內(nèi)發(fā)生白斑病綜合征病毒（WSSV）暫停各國(guó)生蝦進(jìn)口，給包括湛江在內(nèi)的中國(guó)水產(chǎn)品出口企業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重?fù)p失，產(chǎn)業(yè)發(fā)展面臨困境。

為扭轉(zhuǎn)不利局面，湛江檢驗(yàn)檢疫局主動(dòng)應(yīng)對(duì)，加強(qiáng)轄區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)疫病監(jiān)測(cè)，提升產(chǎn)品質(zhì)量，增強(qiáng)湛江水產(chǎn)品國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力，并協(xié)助做好與澳方的溝通交涉，推動(dòng)禁令解除。

（www.bbwfish.com）

Development of coloidal gold immunochromatographic plate for white spot syndrome virum

Liu Changjun1,Wang Zhenguo2,Chen Qingzhou2,Xia Wuqiang1,Miaoweng Shengtu2,Ping Xiating2
（1.Xiangshan Ocean and Fishery Quality and Technical Testing Center，Ningbo 315700，China；2.Hangzhou Nankai Biotech Co.，Ltd.，Hangzhou 311215，China）

A coloidal gold immunochromatographic plate for white spot syndrome virum in shrimp was developed.The colloidal gold conjugate pad combined anti－white spot syndrome virus monoclonal antibody.The anti－white spot syndrome virus polyclonal antibody and goat anti－mouse IgG were coated on test line and control line，respectively.White spot syndrome virum could be detected by this plate through double antibody sandwich method.The results of this paper showed that detection limit of the plate was 1.0 mg/kg，the specificity and the stability of the plate were high，and the results could be known just in 8～10 min.This plate was suitable for rapid detection in outdoors.

white spot syndrome virum；double antibody sandwich method；immunochromatographic；coloidal gold

S917

A

1004－2091（2017）10－0001－06

10.3969/j.issn.1004－2091.2017.10.001

杭州市科技發(fā)展計(jì)劃（20150432B34）

劉長(zhǎng)軍（1978－），男，高級(jí)工程師，研究方向?yàn)樯餀z測(cè)技術(shù).E－mai:xs65763110@126.com

2017－01－09）