視網膜神經信號的調制和視網膜疾病

楊雄里

(復旦大學腦科學研究院 上海 200032)

專家簡介楊雄里,1941年出生,神經生物學家,生理學家,中國科學院院士(1991年當選),發展中國家科學院院士(2006年)。1958—1960年在上海第一醫學院醫療系學習,1963年畢業于上海科技大學,1982年在日本獲學術博士學位。現為復旦大學教授,腦科學協同創新中心主任,腦科學研究院學術委員會主任,《辭海》、《大辭海》副主編,ProgNeurobiol雜志國際顧問編委,國內外多所大學榮譽教授或客座教授。曾任中國科學院生物學部副主任(1991—1996年),中科院上海生理研究所所長(1988—1999年),中國生理學會理事長(1998—2002年),《生理學報》主編(1988—2002年),《中國神經科學雜志》主編(1996—2005年),973項目“腦功能和腦重大疾病的基礎研究”首席科學家(1999—2004年),復旦大學神經生物學研究所所長(2000—2010年),腦科學研究院院長(2006—2009年),亞大地區生理學聯合會第一副主席(FAOPS)(1994—1998年)、秘書長(2006—2011年)。第十、十一屆全國政協委員。

在視網膜中信號傳遞處理及其機制研究方面取得了若干重要成果,已發表學術論文250余篇,專著、譯著多冊,曾獲中科院自然科學一等獎(1989年),教育部自然科學一等獎(2006年),上海市自然科學一等獎(2006年),何梁何利科技進步獎(2001年),上海市科技精英(1991年),上海市科普教育創新杰出人物獎(2013年)等。

上海醫學院創建90周年寄語在科學上樹“會當凌絕頂”的決心,在育人中懷“甘為孺子牛”的精神,強而不驕,謙而不萎,益整旗鼓,再鑄輝煌。

視網膜神經信號的調制和視網膜疾病

楊雄里△

(復旦大學腦科學研究院 上海 200032)

本文概述了作者所領導的團隊近年來在視網膜研究方面的主要工作。在基礎研究方面,集中介紹了褪黑素對視網膜神經元的神經調制作用;而在與臨床相結合的研究方面,則涉及青光眼的發病機制,特別是Müller膠質化激活和ephrin/Eph信號系統的反向信號在視網膜神經節細胞凋亡中的作用。最后論及視網膜多巴胺在眼屈光系統發育及形覺剝奪性近視形成中的作用,以及多巴胺與屈光發育和近視形成的關系。

視網膜; 視網膜疾病; 神經信號

最近10年來(2007—2017年),我除了繼續推進視網膜的基礎研究之外,開始努力把研究和臨床問題結合起來。基礎和臨床結合固然是當前生命科學的一個重要趨勢,也反映了我自己強烈的心愿。在基礎研究方面,我著重分析了褪黑激素(melatonin,MEL)、促醒素(orexin)對視網膜神經信號的調制;在與臨床相結合方面,則致力于對青光眼、糖網病和近視眼的發病機制進行探索。本文將結合學科發展趨勢從幾個側面介紹我的實驗室的部分研究成果,作為向上醫創建90周年慶典的匯報。

褪黑素(MEL)對視網膜信息的神經調制作用在脊椎動物中,MEL的合成主要發生在松果體和視網膜。其合成和釋放顯示明顯的晝夜節律變化,夜間較高,白晝較低[1]。它參與了多種生理過程的調節,如睡眠、生殖、免疫和心血管反應等[2]。近年來,許多實驗證據顯示了MEL的神經調制作用[3]。在視網膜中,MEL主要在光感受器中合成,其釋放受晝夜節律和光照的調制[3]。

我們第一個研究主題是,在外層視網膜MEL對視桿信號和視錐信號的傳遞進行調制的特點[4]。我們以硬骨魚為實驗動物,因為在魚的外層視網膜,視桿和視錐兩種信號向視網膜第二級神經元——水平細胞和雙極細胞的傳遞基本是分開的,即視桿和視錐的信號分別傳遞至不同類型的水平細胞和雙極細胞。應用細胞內記錄技術,在分離的鯽魚視網膜標本,我們觀察到,生理濃度的MEL使視錐信號驅動的水平細胞(視錐水平細胞)去極化,并使其對光反應減小(圖1A1),MEL的這種作用為MEL的受體MT1、MT2的競爭性拮抗劑luzindole(LUZ)所阻斷。當GABA能、多巴胺能和甘氨酸能輸入均用相應的拮抗劑所阻斷后,MEL的這些作用依然存在,表明這是MEL對水平細胞的直接作用(圖1A2)。相反,MEL使視桿信號驅動的水平細胞膜電位輕微超極化,使其光反應幅度有所增大。我們應用全細胞膜片鉗記錄技術記錄了分離視錐水平細胞上的AMPA受體(谷氨酸受體亞型)介導的電流。實驗進一步顯示,MEL通過增加其效率(efficacy)和表觀親和力(apparent affinity)使AMPA電流增大。MEL的這一效應可以為LUZ所翻轉,但使用MT2受體的特異性拮抗劑不能阻斷MEL的作用,這提示MEL的作用是由MT1受體介導的(圖1A3)。像MEL一樣,鳥苷酸環化酶的抑制劑甲基蘭(MB)也增大AMPA電流,而cGMP的胞內灌流壓抑這些電流。進而,這種MEL的效應在胞內施加cGMP或用MB培養的視錐水平細胞不復存在。所有這些結果都提示,MEL的這一效應是由于MEL激活MT1受體,使胞內cGMP濃度降低而致。由此可對所觀察到的現象作如下解釋:視錐水平細胞表達的MT1受體的激活使AMPA受體更強被激活,使細胞膜電位隨之更接近AMPA受體的翻轉電位(0 mV),這樣就使細胞的驅動力(driving force)減小,其結果是細胞光反應幅度下降。MEL對從視錐向水平細胞的谷氨酸能傳遞的這種調制,可能是這種細胞光反應晝夜節律變化的原因之一。

我們進一步在雙極細胞對MEL的作用進行了研究[5]。如前所述,魚的視桿和視錐信號向雙極細胞的傳遞基本上是分離的,即傳遞至兩類形態不同的細胞。有一類接受視錐信號的“給光型”(ON型)雙極細胞,具有一個明顯膨大的軸突終末,形態上很易識別,也易于進行膜片鉗記錄。我們首先用全細胞膜片鉗技術對這種細胞進行了研究。在視網膜薄片標本上,MEL能誘導出一個持續的內向電流(圖1B1)。實驗表明,這是一個經MT2激活由cGMP依賴的陽離子通道介導的電流。與此相一致,MEL通過抑制磷酸二酯酶(PDE)的活性使胞內cGMP濃度增加;而當用cGMP作胞內灌流時,MEL不再能誘導任何電流。我們還測試了MEL對這種細胞的光反應的影響。為了避免來自光感受器和水平細胞的突觸前作用,采用了Snellman和Nawy(2004)首先提出的模擬光[6],即視網膜鋪片用飽和濃度的L-AP4(代謝型谷氨酸受體mGluR6的激動劑)作連續灌流來模擬“暗”,而在L-AP4連續灌流的過程中,短暫施加CPPG(mGluR6的拮抗劑)至細胞的樹突,以此模擬光刺激。如圖1B3 (左)所示,MEL使細胞對此模擬光的反應增大,而這種效應為cGMP依賴激酶所介導。進而,MEL增大暗視ERG b波的幅度(圖1B4),這是一個可預測的結果,因為b波反映的是雙極細胞的活動。MEL對接受視錐信號的雙極細胞的作用則完全不同。雖然MEL使這些細胞胞內cGMP水平升高,但不能誘導電流。這些結果提示,夜間釋放的MEL可能用于提高夜間雙極細胞的對光反應靈敏度,從而使弱光引起的視桿信號超出背景噪音水平。以上的實驗結果可歸納于圖1C、D模式圖。MEL增大由視桿至雙極細胞的信號傳遞,卻使視錐至水平細胞的信號傳遞下降。MEL這兩種不同的作用分別由MT1和MT2介導,前者使胞內cGMP下降,而后者使之增高。

A:Melatonin modulates carp cone-driven horizontal cells (H1 cells).A1:Intracellular recording of a H1 cell from whole-mount carp retina.Melatonin (MEL) of 25 nmol/L depolarized the cell and reduced the amplitudes of the light responses.Co-application of the MT1/MT2receptor antagonist luzindole (LUZ) of 250 nmol/L blocked the melatonin effects.A2:When dopaminergic,GABAergic and glycinergic synaptic transmission was blocked by application of a mixture of spiperone (Spip),SCH 23390 (SCH),picrotoxin (PT) and strychnine (Stry),melatonin was still capable of depolarizing the cell and reducing the response amplitudes.A3:In an H1 cell,glutamate (3 mmol/L)-induced current was potentiated by 10 nmol/L melatonin,which was blocked by 100 nmol/L LUZ,but not by the MT2specific antagonist K185 of 100 nmol/L.B:Melatonin modulates carp rod-dominant bipolar cells (Rod-ON-BCs).B1:Melatonin of 100 nmol/L induced a sustained inward current from a Rod-ON-BC,which was blocked by the MT2receptor specific antagonist 4-P-PDOT of 100 nmol/L.B2:Internal infusion of 2 mmol/L cGMP induced a sustained inward current,and addition of 100 nmol/L melatonin failed to further induce any current.B3:Left,Response of a Rod-ON-BC to simulated light flash was potentiated by melatonin (100 nmol/L);Right,With internal infusion of the cGMP-dependent kinase antagonist KT5823 (10 μmol/L),melatonin of 100 nmol/L failed to potentiate the simulated light-induced response.B4:Melatonin (100 nmol/L) potentiated the scotopic b-wave,which was blocked by 100 nmol/L 4-P-PDOT.C and D:Schematic diagrams showing the signaling pathways of how melatonin modulates cone signal to the horizontal cell (C) and rod signal to the bipolar cell (D) in carp retina.In the horizontal cell (HC),melatonin decreases intracellular cGMP concentration by activating the MT1receptor,which may lead to a stronger activation of the AMPA receptor.In the rod-driven ON type bipolar cell (ON-BC),melatonin,through activating the MT2receptor,increases intracellular cGMP concentration,which potentiates the light response that is mediated by the transient receptor potential M1 (TRPM1) channel coupled to the mGluR6 receptor.Modified from Huangetal[3]of our own group.

圖1褪黑素(MEL)以不同的方式調制外層視網膜中視錐和視桿信號
Fig1Melatonindifferentiallymodulatesconeandrodsignalsintheouterretina

我們的研究工作進而又拓展至MEL對大鼠視桿給光型雙極細胞活動、神經節細胞甘氨酸電流的調制[7-9],從而對MEL在視網膜中的神經調制作用及其機制,形成了較全面的認識。應ProgRetinEyeRes雜志主編Osborne的邀請,我們撰寫了長篇綜述[3],可供有興趣的讀者參閱。

對青光眼和近視眼發病機制的研究

青光眼研究

高眼壓引起Müller細胞的膠質化激活,導致神經節細胞的丟失 青光眼是一種重要的致盲性疾病,眼壓過高引起神經節細胞凋亡的機制仍然是一個懸而未決的問題。在建立了慢性高眼壓大鼠模型后,我們研究的第一個問題是,視網膜Müller細胞膠質化激活(gliosis)是否和神經節細胞的凋亡有關。膠質細胞的重激活見于幾乎所有的中樞神經系統疾病[10],包括多種視網膜的疾患[11]。我們首先用免疫組化方法,在正常大鼠顯示,內向整流鉀通道(Kir 4.1)蛋白表達于Müller細胞;當處于高眼壓時,Müller細胞表達GFAP增加,而表達的Kir 4.1 蛋白水平降低,相應的Kir 4.1電流也減小。我們對此現象提出了一個工作假設:在高眼壓大鼠模型,胞外谷氨酸濃度增加,使代謝型谷氨酸受體(mGluR)中的一種亞型mGluR5過度激活,從而抑制Kir電流。這一工作假設已為實驗所證實。在由正常視網膜分離的Müller細胞上,mGluR I的選擇性激動劑DHPG壓抑Kir電流,這種壓抑作用能被MPEP(mGluR5的拮抗劑)所阻斷。藥理學實驗進一步顯示,介導DHPG效應的是:胞內鈣依賴的PLC/IP3-rynordine/PKC信號通路,而cAMP-PKA通路并未參與其中。如果在正常大鼠玻璃體中注射DHPG會使Müller細胞產生類似于在慢性高眼壓大鼠所見的變化,而DHPG所誘導的GFAP在Müller細胞上表達的增加能為Ba+所阻斷,提示Kir通道參與這一效應。所有這些結果表明,高眼壓所致胞外谷氨酸濃度的增高可使mGluR5過度激活,壓抑Kir通道,從而使Müller細胞產生膠質化激活[12](參見圖2模式圖)。這意味著:如果以某種方式使青光眼情況下視網膜mGluR5的活性適當降低,從而減輕Müller細胞的再激活,有可能是防止神經節細胞丟失的一種有效途徑。

圖2 高眼壓情況下Müller細胞如何發生膠質化的模式圖Fig 2 A schematic drawing showing how gliosis of Müller cells is caused under ocular hypertension

高眼壓引起EphB/ephrin B反向信號的激活導致神經節細胞的凋亡 ephrin/Eph信號系統的特點是產生雙向性信號,其正向信號作用于表達Eph (受體)的細胞,而反向信號作用于表達ephrin(配體)的細胞[13]。研究這一系統在高眼壓所致神經節細胞死亡中的作用,是我們青光眼研究中的另一個主題[14]。首先,免疫組化實驗顯示,EphB1在Müller細胞表達,而ephrinB2除Müller細胞外,也在神經節細胞表達,EphB1和ephrinB因此在神經節細胞組成了EphB/ephrinB反向信號系統。在慢性高眼壓大鼠,EphB1和ephrinB2表達顯著增高,反向信號激活,伴有磷酸化(p)-src激酶、AMPA受體GluA2亞基和pGluA2蛋白水平的增高。在正常視網膜,將EphB2-Fc(EphB2的激動劑)作玻璃體內注射,其TUNEL正信號增加,免疫共沉淀測試表明在ephrinB2、p-src和GluA2之間存在直接的相互作用。此外,在慢性高眼壓大鼠,視網膜細胞表面的GluA2蛋白的表達降低。這種GluA2的胞吞(endocytosis)能為手術前玻璃體內注射PP2(src家族酪氨酸激酶的抑制劑)所阻斷。在正常大鼠玻璃體內注射EphB2-Fc,上述蛋白水平發生與慢性高眼壓大鼠上觀察到的相似的變化,這些變化均能為手術前注射PP2所阻遏。膜片鉗實驗進一步顯示,在獲PP2注射的大鼠,神經節細胞的由 AMPA受體介導的興奮性突觸后電流(EPSC)的電流-電壓關系具有更強的內向整流特性。進而,在獲EphB2注射的大鼠或慢性高眼壓大鼠,若手術前注射PP2或Naspm(鈣通透的無GluA2亞基AMPA受體的抑制劑),則神經節細胞的凋亡大幅降低。從這些結果可以得出推論:EphB2/ephrinB2反向信號的激活所引起的GluA2 trafficking的升高,是引起慢性高眼壓大鼠神經節細胞凋亡的原因之一。這些成果歸納于圖3的模式圖。

圖3高眼壓情況下EphB/ephrinB反向信號的激活
如何導致視網膜神經節細胞的凋亡
Fig3AschematicdrawingshowinghowtheactivationofEphB/ephrinBreversesignalingleadstoapoptosisofretinalganglioncellsunderocularhypertension

近視眼研究 主要圍繞多巴胺(dopamine,DA)在眼的屈光發育和近視形成中的作用這樣一個中心問題展開研究。

按目前主流的觀點,在近視形成的過程中DA是一個起關鍵作用的重要信號分子[15],其在視網膜中的濃度在近視時降低,提示視網膜中DA 能無長突細胞結構和功能的改變。近年來由于遺傳操作較易進行,小鼠已成為近視研究的一種重要的動物模型。我們在參加有關近視研究的973項目時,作為研究工作的一項重要基礎,首先需要確定在形覺剝奪導致近視(FDM)形成的CB57小鼠模型視網膜DA濃度是否以及如何發生變化的[16]。

在成功建立的C57BL/6小鼠FDM模型上(在形覺剝奪4周內,眼的屈光度發生 5.0 D的變化),用HPLC技術測定了視網膜DA的濃度。出乎意料,在形覺剝奪4周所造成的近視眼上獲得的數據,與同一動物對照組之間差異并無統計學意義。不僅如此,DA的代謝產物DOPAC的含量,不管在視網膜中還是玻璃體中,與對照組差異均無統計學意義。反映胞外DA水平的多巴胺轉運體的表達也未發生變化。與這些現象相一致,形態學研究表明,視網膜中唯一產生DA的無長突細胞的數量和它們的突起所占據的平均面積,乃至酪氨酸羥化酶(DA的合成酶)的表達,均未發生改變。所有這些結果都清楚表明,C57BL/6小鼠當形成FDM時,其視網膜的DA系統基本不受影響;在這種小鼠,視網膜DA水平與FDM的發展并無關聯。

對DA在近視的作用持有傳統觀點的研究者對我們的這一結果提出了強烈的質疑,這充分反映在當論文投寄InvestigativeOphthalmologyandVisualScience雜志后評審專家表示的意見中。他們的總體觀點是:這項結果強烈地挑戰有關DA在屈光發育過程中作用的現代觀點,即研究結果必須是無可挑剔的。他們對結果提出了長達數十頁的問題和質疑。為了回答這些質疑,我們又補充了許多實驗結果,數易其稿,從送審日算起,歷經一年半之久才正式發表。

那么,DA在屈光發育中究竟起什么作用呢？我們接著采用6-羥多巴胺(6-OHDA)人為地使視網膜DA水平降低,考察對屈光發育的影響。6-OHDA是一種神經毒性物質,特異地損毀多巴胺能細胞,從而使DA水平降低。當玻璃體內注射6-OHDA的劑量為6.25 μg和12.5 μg時,視網膜DA和酪氨酸羥化酶水平顯著降低。但ERG a波 和b波幅度并不受到影響,這表明在這兩個濃度6-OHDA注射時,所產生的效應主要由于6-OHDA對DA能神經元特異作用所致。在正常視覺環境中,6-OHDA以劑量依賴的方式誘導近視性屈光偏移。特別值得注意的是,形覺剝奪在6-OHDA注射的眼能誘導程度更深的近視性屈光偏移,但卻并不引起DA的進一步下降。光學參數測定顯示,盡管6-OHDA注射和形覺剝奪均引起近視性屈光變化,但原因是不同的:在前者是由于眼軸變短,而角膜曲率變得更大,在后者的情況下,則是眼軸增長,角膜曲率不變[17]。

綜合以上結果,可以作出如下的推論:在C57BL/6小鼠,對于屈光調節存在兩種不同的機制,一種依賴于DA,另一種不依賴于DA,這兩種機制以不同的方式運轉(圖4)。這個推論是否能拓展至人類,尚需進一步實驗的驗證。但是這兩種機制的存在,顯然有助于機體能按照各種不同的環境,以不同的機制來調節屈光系統的發育。另一方面,這兩種機制同時存在的可能性提示我們,在考慮如何防止近視的發生以及矯正近視時采取何種措施,一定要十分謹慎,不能只考慮存在多巴胺依賴性一種機制。

圖4 參與大鼠眼球屈光發育和形覺剝奪近視形成的兩種機制:多巴胺(DA)依賴及DA非依賴的Fig 4 A schematic drawing showing that both dopamine-dependent and dopamine-independent mechanisms,underlying myopic refractive shifts,coexist in mouse retina

致謝本文是我的實驗室近十年部分工作的小結。這些工作中有許多是我的同事鐘詠梅、王中峰、翁史均、苗艷穎領導的研究小組完成的,他們和眾多學生的貢獻構成了這篇文章的主體。藉此機會,謹對所有參與研究的人員表達作者深切的謝意。我們的研究多年來得到科技部、教育部、基金委、上海市科委的多項基金資助,關于這些基金的具體信息均在原始論文發表的雜志上清楚地標明,限于篇幅,不再詳述。

為節省篇幅,本欄列出的文獻僅為與本文有關的主要文獻,詳細的參考文獻請參閱本人相關論文所引述之引文目錄。

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Modulationofretinalinformationandretinaldiseases

YANG Xiong-li△

(InstitutesofBrainScience,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

In this article a general account of the major results in retina research obtained by my team in the past ten years is provided.The basic research of my team is exemplified by the study of neuromodulatory action of melatonin on retinal neurons.This is followed by a brief description of our endeavor in exploring the pathogenesis of glaucoma,focusing on the involvement of Müller cell gliosis a nd reverse signaling of the ephrin/Eph signaling system in apoptosis of retinal ganglion cells.Finally,our recent studies,concerning roles retinal dopamine (DA) plays in refractive development and form-deprivation myopia (FDM) are presented.Our results strongly suggest that a DA-independent mechanism may work together with a DA-dependent mechanism,mediating refractive development and FDM formation.

retina; retinal diseases; neural signal

R774

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2017.06.001

△Corresponding author E-mail:xlyang@fudan.edu.cn

2017-09-26;編輯:張秀峰)