液相色譜串聯質譜法測定輻照魚醬中多種氨基酸及同分異構體

邵宏宏，相興偉，王琦，周向陽，周秀錦，沈飚，傅謐妮

(1.舟山出入境檢驗檢疫局，浙江 舟山 316000；2.浙江省海洋開發研究院，浙江 舟山 316000)

液相色譜串聯質譜法測定輻照魚醬中多種氨基酸及同分異構體

邵宏宏1*，相興偉2，王琦1，周向陽1，周秀錦1，沈飚1，傅謐妮1

(1.舟山出入境檢驗檢疫局，浙江 舟山 316000；2.浙江省海洋開發研究院，浙江 舟山 316000)

建立了液相色譜串聯質譜法(HPLC-MS/MS)測定魚醬中輻照相關的多種氨基酸及同分異構體的分析方法，并建立了輻照魚醬檢測方法。樣品通過鹽酸水解，采用Waters Sunfire C18柱，0.1%甲酸溶液和甲醇為流動相進行梯度洗脫，正離子(ESI+)模式可快速有效分離及準確測定輻照魚醬中的對酪氨酸(p-Tyrosine)、苯丙氨酸(Phenylalanine)及其輻照特異性產物間酪氨酸(m-Tyrosine)和鄰酪氨酸(o-Tyrosine)的含量。在10～500 μg/L范圍內，所測氨基酸及同分異構體的線性相關系數為0.9985～0.9998，回收率為75.1%～104.5%，相對標準偏差小于8.9%。方法適用于對含蛋白質魚醬中輻照相關的多種氨基酸和其同分異構體的測定，從而對其是否經過輻照進行準確鑒定。

輻照；魚醬；氨基酸；同分異構體；液相色譜串聯質譜

1 概述

食品輻照可有效控制食品中食源性病原體，減少微生物負載和蟲害，抑制生理過程和延長貨架期，被廣泛應用于食品加工和貯存領域[1]。香辛料調味品是應用輻照技術較早且應用最為廣泛的領域之一，目前，中國是亞洲最大的輻照食品生產國[2]。

輻照對食品的品質和安全性的影響還尚未定論，不當的輻照會對食品的感官、營養成分造成一定的影響[3-12]。目前，美國、歐盟等地區對食品輻照有比較詳細的要求，對于食品種類、輻照劑量、輻照設施、食品輻照的標示都有明確的規定。歐盟有關食品輻照的框架指令1999/2/EC和執行指令1999/3/EC分別規定，所有經輻照的食品或含有輻照食品成分的必須在食品標簽上標明，且允許輻照處理的食品中不包括水產品。

深海魚醬是對海洋低值魚類的加工和綜合利用后的一種新型的食品，其富含蛋白質，具有較高的營養價值。由于輻照無二次污染和化學殘留，并對漁藥、農藥及水產品常用的保鮮劑具有一定的抑制和降解作用，近年來輻照技術被廣泛應用于水產品及其制品的加工、運輸及儲存過程中的殺菌保鮮，從而延長貨架期。魚醬制品及其生產的原料來源有可能經過輻照處理。

近年來，我國出臺了多個輻照食品的檢測標準，受方法本身采用的原理所限，每種方法均適用于特定類型的樣品[13-22]。熱釋光分析法(TL)是輻照水產品和香辛料調味品檢測的常用方法，歐盟EN 1788法規中對輻照水產品檢測也采用了該法[23]。魚醬在其加工過程中經過了去內臟、脫腥處理、蒸煮，尤其是多次漂洗，實際檢測過程中很難提取到足夠量的礦物質用于熱釋光分析法檢測，目前對該類產品的檢測還存在一定的難度。食品經輻照后，產生的羥基自由基會進攻含芳環的苯丙氨酸的鄰、間、對位，進而生成酪氨酸3種異構體——對酪氨酸(p-Tyrosine)、鄰酪氨酸(o-Tyrosine)和間酪氨酸(m-Tyrosine)[24,25]。除對酪氨酸外，鄰酪氨酸(o-Tyrosine)和間酪氨酸(m-Tyrosine)本身在基體中不存在。本文基于HPLC-MS/MS技術，通過測定苯丙氨酸、酪氨酸及輻照特異性產物o-Tyrosine和m-Tyrosine的含量建立輻照魚醬的檢測方法。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

樣品：魚醬由舟山市水產加工企業提供，其原料來源為各類深海低值魚類，-20 ℃保存備用。

氨基酸標準品：DL-Tyrosine (CAS：556-03-6，純度≥99.0%)、間酪氨酸(CAS：775-06-4，純度≥99.0%)、鄰酪氨酸 (CAS：2370-61-8，純度≥98.0%)、丙苯氨酸(CAS：150-30-1，純度≥99.0%)均為美國Sigma-Aldrich公司產品；分別準確稱取一定量標準品，用少量水溶解，加水定容至100 mL。使用時用超純水將上述標準品逐級稀釋成不同濃度的混合標準溶液，上機前以0.22 μm微孔濾膜過濾。

試劑：丙酮、甲醇均為色譜純，德國默克公司；去離子水(電阻率18.2 MΩ·cm)，經0.22 μm微孔濾膜過濾后使用；甲酸，Riedel deHaen公司；鹽酸。

API3000高效液相色譜串聯質譜儀：美國AB Sciex公司，配有溶劑脫氣裝置、自動進樣器；天平(感量0.0001 g)；超聲波清洗器：德國Elma公司；MSI漩渦振蕩器：德國IKA公司；3-18K低溫高速離心機：美國Sigma公司；恒溫干燥箱：美國Thermo Fisher公司；0.22 μm尼龍濾膜過濾頭。

2.2 方法

2.2.1 樣品前處理

將待測的魚醬充分混勻，攪碎后裝入容器內，密封、冷藏(-18 ℃)備用；準確稱取0.5 g (精確至0.01 g)，經前處理后的樣品于20 mL酸解玻璃管中，加入10 mL 6 mol/L鹽酸，充氮氣后蓋緊旋蓋，于110 ℃下酸解過夜。取酸解液用濾紙過濾后，置于玻璃離心管中，4 ℃，12000 r/min離心10 min。取上清液5 mL，35 ℃，N2吹干，剩余的液體用冷凍凍干機凍干。用1 mL 0.1%(V/V)甲酸水溶液溶解，用0.22 μm水相尼龍濾膜過濾。取10 μL濾液用 0.1%(V/V)甲酸水溶液定容至1 mL，即稀釋100倍，2個濃度的樣品均用HPLC-MS/MS法測定對酪氨酸和苯丙氨酸。

2.2.2 色譜及質譜條件

2.2.2.1 色譜分離條件

采用Waters Sunfire C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流速0.2 mL/min；流動相A：0.1%(V/V)甲酸水溶液，流動相B：甲醇；進樣量：20 μL；柱溫：35 ℃；色譜梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

2.2.2.2 質譜條件

離子源Turbo V，電離模式ESI+，采集方式MRM模式，離子化溫度(TEM)500 ℃；噴霧電壓5000 V，霧化氣(GS1)55 psi，輔助氣(GS2)60 psi，氣簾氣(CUR)10 psi，碰撞氣(CAD)為 High；入口電壓(EP)12 V，碰撞室出口電壓(CXP)10 V。各化合物的具體采集參數見表2。

表2 優化的質譜條件參數Table 2 Optimized parameters of mass spectrum conditions

2.2.3 測定方法

將標準儲備液逐級稀釋成濃度為10，20，50，100，500 μg/L的氨基酸及同分異構體的混合標準溶液，按上述條件測定；分別取未經任何加工和輻照的待測樣品及經1,7 kGy輻照后的樣品，與待測樣品一起進行前處理和上機測定。

3 結果與分析

3.1 樣品提取方式的選擇

對2種提取方式進行了考察。對樣品分別進行1，2，5，7，10，20 kGy劑量的輻照。將上述樣品分A，B 2組，分別以不同方式進行提取和前處理，并將結果進行比對。A組樣品加入0.1%(V/V)甲酸水溶液直接提取，均質后室溫下超聲振蕩提取30 min，4 ℃溫度下12000 r/min離心后取上清液，加入丙酮于-18 ℃下沉淀蛋白質，4 ℃溫度下高速離心后取上清液N2吹干。B組樣品置于20 mL酸解玻璃管中，加入10 mL 6 mol/L鹽酸，充氮氣后蓋緊旋蓋，于110 ℃下酸解過夜。取酸解液用濾紙過濾后，置于玻璃離心管中，4 ℃，12000 r/min離心后取上清液35 ℃下N2吹干，剩余的液體用冷凍凍干機凍干。樣品吹干后均用1 mL 0.1%甲酸水溶液(V/V)溶解，用0.22 μm水相尼龍濾膜過濾。

上機測定后結果顯示：A，B 2組中未經輻照的樣品中含高濃度的對酪氨酸和苯丙氨酸，未發現鄰酪氨酸和間酪氨酸。A組中經1,2 kGy低劑量輻照的樣品，未能檢測到輻照特異性產物鄰酪氨酸和間酪氨酸，而大于5 kGy輻照后的樣品則能檢測到鄰酪氨酸和間酪氨酸。B組樣品采用鹽酸高溫消解，經不同劑量輻照的樣品中均能檢測到一定量的鄰酪氨酸和間酪氨酸。因此采用1%的甲酸直接超聲提取，在低劑量輻照的樣品中無法提取到足夠量的輻照特異性產物鄰酪氨酸和間酪氨酸用于輻照檢測。采用鹽酸水解的前處理方式比0.1%的甲酸直接超聲提取具有更好的提取效率，因此選擇高溫酸水解進行氨基酸提取。

3.2 高溫水解對輻照特異性產物的影響

含蛋白質食品中的苯丙氨酸經輻照后可產生鄰酪氨酸和間酪氨酸，本文通過測定水產品中是否含這2種同分異構體確定樣品是否經過輻照，為確定這2種同分異構體是輻照水產品的特征性產物，前處理中長時間的高溫水解不會導致樣品中產生鄰酪氨酸和間酪氨酸，對110 ℃條件下4,8,12,24 h水解后未經輻照樣品中的氨基酸進行了測定，結果顯示樣品中均未檢測到鄰酪氨酸和間酪氨酸。因此高溫下長時間的水解不會導致樣品產生鄰酪氨酸和間酪氨酸，對這2種氨基酸作為判斷樣品是否經過輻照的特征性產物不會產生影響。

3.3 樣品水解時間的優化

水產品中氨基酸的測定通常采用110 ℃下進行水解，因輻照后產生的酪氨酸異構體含量較少，為保證其完全水解并提高檢測效率，分別考察了不同水解時間對氨基酸回收率的影響，確定110 ℃下最佳水解時間。結果顯示(見表3)：樣品經8 h以上水解后，各種氨基酸含量從最初的快速增長逐漸趨于穩定，在12～24 h水解后，各含量達到最高值，在保證水解效率前提下為盡量減少前處理時間，縮短檢測周期，水解時間選擇12 h為最佳。

表3 110 ℃不同水解時間對含量(mg/kg)的影響Table 3 Effect of different hydrolysis time on concentrate of amino acid (mg/kg) at 110 ℃

注：ND為未檢出。

進一步考察了高溫水解時間對各氨基酸回收率的影響。取未經輻照的樣品，加入m-Tyrosine和o-Tyrosine的標準溶液使其濃度分別為1000,5000 μg/kg，由于水產品中自身所含苯丙氨酸和對酪氨酸含量較高，因此加標濃度較高。110 ℃水解不同時間進行提取，上機測定前取前處理后未添加的空白樣液加入同樣濃度的各氨基酸標準溶液，同時上機測定。通過與前處理后的樣品添加濃度比較計算回收率，12 h水解后各氨基酸均達到實驗要求(見表4)，目標物無明顯損失。因此選擇高溫酸水解12 h進行前處理為最佳。

表4 110 ℃不同水解時間對回收率(%)的影響Table 4 Effect of different hydrolysis time on recovery rate (%) at 110 ℃

3.4 色譜條件的優化

3.4.1 色譜柱的選擇

由于對酪氨酸在水產品中大量存在，其與因輻照后產生的鄰酪氨酸和間酪氨酸為同分異構體，分子量相同，會產生相同的MRM離子對，因此無法只通過MRM離子對進行定性和定量，需結合各個氨基酸的出峰時間進行準確檢測。并且3種同分異構體出峰時間相近，需要通過液相部分進行有效的分離，色譜柱的選擇尤為重要。考察了不同填料及不同規格的色譜柱對酪氨酸同分異構體及苯丙氨酸的分離效果， Waters Sunfire C18色譜柱能將4種氨基酸有效分離，且峰形較好，并結合流動相的梯度洗脫程序，其余的色譜柱分離效果不佳，無法達到實驗要求。

圖1 p-Tyrosine，Phenylalanine及輻照特異性產物m-Tyrosine 和o-Tyrosine MRM總離子流圖Fig.1 MRM total ion current of p-Tyrosine, Phenylalanine and irradiation-specific products m-Tyrosine and o-Tyrosine

注：1為對酪氨酸；2為間酪氨酸；3為鄰酪氨酸；4為苯丙氨酸。

3.4.2 質譜條件的優化

在ESI+電離模式下，進行一級質譜掃描，然后對母離子做子離子全掃描。作為同分異構體，p-Tyrosine、m-Tyrosine和o-Tyrosine會產生相同的離子碎片，但不同氨基酸產生的相同離子碎片的豐度不同。根據得到的碎片離子信息，選擇豐度較高的2個特征碎片離子作為該氨基酸定量離子(見表2)。并結合色譜有效的分離，對酪氨酸的3種同分異構體進行準確的定性和定量。

3.5 線性范圍、精密度和檢出限

3.5.1 線性范圍與檢出限

將氨基酸標準溶液用0.1%甲酸溶液稀釋配制成不同濃度的混合標準溶液，以濃度(x，mg/L)為橫坐標，在對應保留時間下的定量離子對應峰面積(y)為縱坐標，進行線性回歸。定量離子10～500 μg/L，待測氨基酸線性關系良好(見表5)。以樣品空白信噪比(S/N)的10倍計算方法的定量限為20 μg/kg，以3倍信噪比(S/N)計算檢出限為6 μg/L，能滿足食品安全的檢測需要。

表5 4種氨基酸的回歸方程及相關系數Table 5 Regression equation and correlation coefficient of four kinds of amino acids

3.5.2 回收率與精密度

精密稱取2種來源于不同生產企業的樣品0.5 g，定量加入標準品，使各氨基酸濃度添加量相當于50,100,200 μg/kg，每個水平重復測定6次，測定加標回收率。結果表明回收率在75.1%～104.5%，相對標準偏差小于8.9%(見表6)。

表6 待測氨基酸的平均回收率與相對標準偏差(n=6)Table 6 The average recoveries and relative standard deviation of amino acids to be tested (n=6)

3.6 實際樣品測定

分別從國內市場上及水產加工企業抽取樣品，測定時取未經輻照及經7 kGy輻照后的魚醬制品，與待測樣品同時進行前處理，處理后的樣液用HPLC-MS/MS條件分析。未經輻照樣品中未發現o-Tyrosine和m-Tyrosine，但含有較高含量的苯丙氨酸和對酪氨酸，見圖2。經7 kGy輻照后的魚醬中含有m-Tyrosine和o-Tyrosine(見圖3)。經樣品測定結果顯示：結合離子對及不同酪氨酸的出峰時間進行判斷，只在一份樣品中發現有m-Tyrosine和o-Tyrosine，可判定這類樣品經過了輻照處理。這可能與熟食較高微生物衛生控制要求有關，利用輻照可有效殺滅并控制微生物尤其致病菌的生長，且國內目前允許較低劑量的輻照。

圖2 未輻照樣品MRM圖Fig.2 MRM chromatogram of non-irradiated sample

注：1為p-Tyrosine；2為Phenylalanine。

圖3 經輻照后樣品MRM圖Fig.3 MRM chromatogram of irradiated sample

注：1為p-Tyrosine；2為m-Tyrosine；3為o-Tyrosine；4為Phenylalanine。

4 結論

針對魚醬制品采用了酸高溫水解的提取方式，可達到對待測物質的有效提取。采用了HPLC-MS/MS方法對輻照樣品進行檢測，可在30 min內完成對輻照相關多種氨基酸及其同分異構體的分離和定量檢測，解決了氨基酸同分異構體難分離、難測定的問題，為魚醬的營養成分分析提供了依據，并在此基礎上建立了判斷魚醬制品是否經過輻照的有效方法。該方法定性分析結果可靠、檢測限低，不需要二次輻照，解決了輻照海產調味品檢測無方法可依的問題，尤其是無法提取硅酸鹽用于熱釋光檢測的樣品的輻照檢測問題，適用于輻照海產調味品的快速檢測。

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DeterminationofAminoAcidsandIsomersinIrradiatedFishPastebyHPLC-MS/MS

SHAO Hong-hong1*, XIANG Xing-wei2, WANG Qi1, ZHOU Xiang-yang1, ZHOU Xiu-jin1, SHEN Biao1, FU Mi-ni1

(1.Zhoushan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Zhoushan 316100, China； 2.Zhejiang Marine Development Research Institute, Zhoushan 316000, China)

A credible HPLC-MS/MS method for determination of isomers of Tyrosine and Phenylalanine is established to identify the irradiated fish paste. The sample is dissolved with hydrochloric acid. The separation is achieved on Waters Sunfire C18column by mobile phase of methanol and 0.1% formic acid for gradient elution. The positive ion (ESI+) mode can be used for rapid and effective separation and accurate determination of the content ofp-Tyrosine, Phenylalanine andm-Tyrosine ando-Tyrosine in the irradiated specific products. In the range of 10～500 μg/L, the linear correlation coefficient of the measured amino acids and isomers is 0.9985～0.9998, the relative standard deviation is less than 8.9%.The method is suitable for the determination of a variety of amino acids and their isomers related to irradiation in protein-containing fish paste, so as to accurately identify whether they are irradiated.

irradiation；fish paste；amino acid；isomers；HPLC-MS/MS

TS264.2

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.12.032

1000-9973(2017)12-0141-06

2017-07-15 *通訊作者

浙江省自然科學基金項目(LQ15c200005)；浙江省公益技術研究農業項目(2015C32101)；浙江省科技計劃項目(2016C37041)

邵宏宏(1981-)，女，工程師，碩士，研究方向：色譜分離分析。