功能菌對泡菜風味物質形成的影響

陳卓，黃丹，于華，唐姣，羅雪，毛祥，唐平

(四川理工學院 生物工程學院，四川 自貢 643000)

功能菌對泡菜風味物質形成的影響

陳卓，黃丹*，于華，唐姣，羅雪，毛祥，唐平

(四川理工學院 生物工程學院，四川 自貢 643000)

以分離于自然發酵泡菜中的植物乳桿菌和酵母菌作為功能菌強化發酵制作泡菜；并研究功能菌對泡菜風味物質形成的影響。采用高效液相色譜法、頂空固相微萃取-氣質聯用技術對發酵泡菜中有機酸和揮發性香氣成分進行分析檢測，研究酵母菌不同接種量對泡菜風味物質的影響。結果表明：酵母菌接種量為0.5%時，泡菜中風味物質較多；自然發酵泡菜風味與人工接種功能菌發酵泡菜風味差異較大，不同發酵時間和接種量的泡菜風味物質的種類和含量也有所差異，發酵過程中共檢出6種有機酸和41種揮發性成分，其中有機酸中草酸、乳酸含量較高，揮發性成分中酯類、醇類、酚類以及二甲基硫化物相對含量較高，是白蘿卜泡菜的特征風味成分。

泡菜；功能菌；有機酸；揮發性成分

泡菜是我國一種傳統而大眾化的發酵食品，具有典型代表性，歷史悠久，工藝傳承千年，為中華傳統生物食品之瑰寶。其發酵原理是在自然條件下微生物利用原料中的營養物質進行發酵，形成泡菜特殊的色澤和風味[1]。其具有鮮酸可口、質地脆嫩、風味獨特、營養豐富等特點，經常食用可達到防病治病、保健和延年益壽的功效，因此深受廣大消費者喜愛。目前我國泡菜的生產主要采用自然發酵和人工接種發酵2種方式[2]。自然發酵雖然口味醇厚，但其生產周期較長、產品質量不穩定、食用期較短，且易受腐敗菌污染等問題，不能適應工業化生產的要求[3]，所以選擇合適的發酵劑進行人工接種，使泡菜產品風味與自然發酵泡菜的產品風味相近，實現大規模生產，具有較高的經濟價值和市場前景。

泡菜的風味物質除原料本身外，最主要來自微生物發酵所產生的代謝產物。國內外對泡菜風味做了多方面的研究，Soon-Mi Shim等[4]研究了韓國泡菜低溫儲藏過程中有機酸的變化，發現乳酸和乙酸是主要的有機酸，蘋果酸在最初的儲藏階段迅速減少。劉春燕等[5]研究了不同乳酸菌接種對發酵泡菜風味的影響，發現不同乳酸菌發酵的泡菜揮發性成分及有機酸的種類差異不顯著。徐丹萍等[6]對泡菜自然發酵過程中品質及揮發性成分進行了分析，結果得到硫氰酸甲酯、(E)-丁酸-4-己烯酯、乙酸己酯、葉醇、正己醇、β-蒎烯、二甲基二硫和二甲基三硫對泡菜風味形成影響較大。本文在前期研究的基礎上，采用高效液相色譜法、頂空固相微萃取-氣質聯用技術對泡菜中的風味成分進行定性定量分析研究，比較自然發酵和人工接種功能菌發酵的泡菜的風味成分，確定泡菜中的主體風味成分，既可為功能菌發酵泡菜取代自然發酵泡菜提供理論依據，又可為提高泡菜產品質量打下堅實基礎，為泡菜工業化生產起指導作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原材料

新鮮白蘿卜：自貢市沃爾瑪超市購買；植物乳桿菌(L.plantarum)、維克漢姆酵母(Wickham yeast)：四川理工學院生物工程學院實驗室提供，分離于自然發酵泡菜中。

氫氧化鈉、氯化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、磷酸氫二銨、磷酸、檸檬酸、酒石酸、乳酸等：以上藥品均為分析純；琥珀酸、草酸、蘋果酸、乙酸：以上藥品均為色譜純。

1.1.2 培養基

MRS培養基用于乳酸菌的活化、培養和計數；YPD培養基用于酵母菌的活化、培養。

1.1.3 儀器與設備

土陶壇；LRH-250恒溫培養箱、電熱恒溫鼓風干燥箱 上海齊欣科學儀器有限公司；潔凈工作臺 蘇州凈化儀器有限公司；立式自動壓力蒸汽滅菌鍋 致微儀器有限公司；BH200生物顯微鏡 寧波舜宇儀器有限公司；CP214電子天平 奧豪斯儀器有限公司；0.45 μm水系微孔濾膜 上海醫藥工業研究院；數控超聲波清洗器 昆山市超聲波儀器有限公司；高效液相色譜儀、氣相色譜-質譜聯用儀 美國 Agilent公司；固相微萃取裝置：包括手柄、導向桿、85 μm CAR-PDMS萃取纖維頭 美國Supelco公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子發酵劑

分別將實驗室保藏的植物乳桿菌和維克漢姆酵母在相應的MRS平板培養基、YPD平板培養基上活化，再取1環活化的菌種，接種于相應的平板培養基上培養至對數后期，用生理鹽水洗下，計數，以此作為接種白蘿卜的種子發酵劑。

1.2.2 泡菜制備

1.2.2.1 自然發酵泡菜

新鮮蘿卜→清洗→切片→分裝→注水→8%食鹽→厭氧發酵6天。設為空白組。

1.2.2.2 功能菌強化發酵泡菜

新鮮蘿卜→清洗→切片→分裝→注水→8%食鹽→接功能菌(乳酸菌：0.375%接種量；酵母菌：不同水平0，0.25%，0.5%，0.75%接種量)→厭氧發酵6天。設為實驗組。乳酸菌以0.375%的接種量是根據前期實驗泡菜液中的總酸和降解亞硝酸鹽的能力確定的。

1.2.3 有機酸的分析

1.2.3.1 樣品前處理

取10 mL泡菜液于100 mL容量瓶中，加入2 mL亞鐵氰化鉀溶液(10.6%)和2 mL硫酸鋅溶液(30%)，搖勻后，用超純水定容，靜置30 min后，先用雙層濾紙過濾，再用0.45 μL微孔濾膜過濾，所得濾液用于高效液相色譜分析[7,8]。

1.2.3.2 液相色譜條件

色譜柱：Gemini 5u C18110A柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)，以5%色譜甲醇-95% 0.5%(NH4)2HPO4(用H3PO4調節pH至2.7)為流動相，流速為0.5 mL/min，柱溫35 ℃，柱壓75 bar，紫外檢測波長210 nm，進樣量10 μL。

1.2.3.3 分析步驟

a.標準曲線制作

準確稱量各有機酸標準品1 g(或1 mL)以超純水溶解并定容至100 mL，即為10.0 mg/mL標準貯藏液。

分別將貯藏液用超純水以5，10，15，20倍稀釋，進樣檢測，分別測定不同標準品出峰時間及其不同濃度所對應的峰面積，制作標準曲線。

b.樣品測定

各待測樣品處理后上機檢測，記錄數據，與標準曲線對照定量計算。

1.2.4 揮發性風味物質的分析

1.2.4.1 固相微萃取萃取條件

將85 μm萃取頭于250 ℃下老化30 min，直至無干擾峰出現。取2 g泡菜碾碎，添加4 mL泡菜汁加入頂空進樣瓶中，并加入2 g NaCl和攪拌子，50 ℃平衡15 min，將萃取頭插入瓶中，推出纖維頭，使之與液面保持1 cm的距離，保溫萃取30 min，攪拌速度為200 r/min，隨后抽回纖維頭，拔出，再插入氣相色譜進樣口230 ℃解吸3 min。

1.2.4.2 氣相色譜-質譜條件[9]

色譜條件：進樣口溫度230 ℃；柱流速為恒定流量1 mL/min；不分流進樣模式：程序升溫：起始溫度40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升到100 ℃，保持1 min，然后以10 ℃/min升到230 ℃，保持7 min。

質譜條件：接口溫度250 ℃；離子源溫度230 ℃；數據采集模式為全掃描；電子能量70 eV；質量掃描范圍33～450 amu。

定性方法：將得到的每個樣品的質譜數據與NIST Library對照相匹配，對匹配度大于80(最大為100)的鑒定結果予以確認。

定量方法：利用圖譜庫工作站數據處理系統按峰面積歸一化法進行定量分析，求得各樣品中揮發性風味物質成分的相對含量。

2 結果與分析

2.1 泡菜的風味成分

食品的風味是食品中許多不同種類、不同數量的風味物質對人體感官的綜合效果[10]。影響泡菜風味的成分包括揮發性成分和不揮發性成分，揮發性成分影響泡菜的香味，即人的嗅覺評價，不揮發性成分影響泡菜的口味，即人的味覺評價。

2.2 泡菜中有機酸的分析

2.2.1 有機酸標準曲線

按1.2.3方法配制7種有機酸標準品溶液，經過HPLC檢測，得到對應的圖譜，見圖1。通過結合文獻和單標結果綜合分析，得出峰1為草酸，峰2為酒石酸，峰3為蘋果酸，峰4為乳酸，峰5為冰乙酸，峰6為檸檬酸，峰7為琥珀酸。以各標準品濃度為縱坐標，峰面積為橫坐標，繪制標準曲線，各標準品的保留時間、回歸方程、相關系數見表1。

圖1 有機酸標準品高效液相色譜圖Fig.1 HPLC of organic acid standard sample

有機酸保留時間(min)回歸方程相關系數草酸5.786y=0.0217x-11.0030.9998酒石酸6.312y=0.0686x-5.09780.9997蘋果酸7.343y=0.1461x-4.80920.9997乳酸8.579y=0.2157x+0.75190.9999冰乙酸9.082y=0.1626x+48.7430.9929檸檬酸10.070y=0.106x+1.95370.9991琥珀酸11.710y=0.2579x-8.54290.9995

注：y為峰面積，x為各有機酸濃度(mg/dL)。

2.2.2 泡菜中有機酸含量分析

在相同測定條件下，通過高效液相色譜法對各發酵泡菜中的有機酸進行檢測，結果與標準品的保留時間相比較，確定其對應的各種有機酸，并根據標準曲線計算有機酸的含量，結果見表2。

表2 發酵泡菜中有機酸的含量Table 2 Content of organic acids in fermented pickles

注：“-”表示未檢測出此物質。

泡菜的不揮發性成分主要包括有機酸和氨基酸等。其品質主要取決于各種有機酸、氨基酸和各種微量元素的含量，其中有機酸是影響泡菜風味和營養的主要物質，在發酵泡菜中酒石酸未檢測出，其原因可能是含量過低，或者是被其他物質干擾所致，檸檬酸、蘋果酸含量比自然發酵泡菜中相對較低，其中檸檬酸具有爽快的酸味，蘋果酸具有溫和爽快的酸味，略帶苦味，而稍有澀感，酸爽尖利的乳酸則含量較高，導致了發酵泡菜的酸味尖利，柔和感不高，琥珀酸是一種具有鮮味的有機酸，其鈉鹽具有獨特的鮮爽味，在泡菜中食鹽的鈉離子作用下呈現鮮味，人工接種發酵與自然發酵中其含量差異不大，可以推測出在鮮味上較為相似。草酸為泡菜中含量最高的有機酸，自然發酵與人工接種發酵泡菜中的含量差異不大。

2.3 泡菜中揮發性風味物質含量分析

將發酵泡菜處理后通過頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術對其揮發性風味成分進行檢測，并對GC/MS檢測到的結果進行分析，得到不同泡菜樣品中主要揮發性成分及相對含量。從5種泡菜樣品中共測定出41種揮發性風味成分，其中酸類物質3種、酯類物質6種、醇類物質10種、二甲基硫化物2種、醚類物質3種、噻吩類物質1種、醛類物質1種、呋喃類物質1種、酚類物質6種、酮類物質1種、烴類物質3種、其他物質4種，結果見表3。

表3 白蘿卜泡菜揮發性風味成分含量Table 3 Content of volatile flavor components in white radish pickles

續 表

注：“-”表示未檢測出此物質。

泡菜的香氣成分對品質的評價起著重要的作用。泡菜中的香氣成分主要來源于原料與發酵過程，由于發酵工藝不同其產品香氣成分及感官鑒定結果截然不同。在上述泡菜樣品中，酵母菌接種量為0.5%時，風味物質的種類最多，含量也相對較高，檢測到的揮發性風味物質主要有酯類、醇類、酚類、醚類、烴類等，其中檢測到的硫化物主要是二甲基二硫、二甲基三硫，且含量相對較高，其閾值很低，低含量就能產生很濃的香味，是泡菜具有獨特風味的主要原因。醇類是常見的揮發性風味物質，泡菜中的醇類可能跟微生物發酵相關。白蘿卜泡菜中醇類占揮發性成分的比例最高，其中主要以乙醇為主體，人工接種功能菌中，乙醇相對含量低于自然發酵中的乙醇相對含量。酯類是具有香氣的揮發性液體，是構成泡菜特殊風味的重要組成部分，在上述泡菜樣品中，酯類在揮發性成分中所占的比例僅次于醇類，以1-異硫代氰酸丁酯、乙酸乙酯為主，人工接種發酵泡菜中酯類種類及含量明顯高于自然發酵泡菜，其原因可能是接種后乳酸菌和酵母菌在發酵過程中產生的代謝產物所致。酚類也是該泡菜樣品的主要成分，影響著泡菜的風味與營養。2-甲基四氫噻吩、2,3-二氫苯并呋喃均未在自然發酵泡菜中檢測出，但在人工接種發酵泡菜中檢測出，且相對含量較高。

總體而言，人工接種發酵泡菜比自然發酵泡菜中揮發性風味物質的種類更多，相對含量更高，其風味物質主要來源于原料本身和微生物在發酵過程中產生的代謝產物。

3 結論

本研究是以高降解亞硝酸鹽乳酸菌和高產酯類酵母菌為人工接種發酵泡菜的發酵劑，在泡菜制作過程中添加不同的接種量制作泡菜，采用高效液相色譜法、頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術對泡菜中的有機酸和揮發性風味物質進行測定分析，結果顯示酵母菌接種量為0.5%時，風味物質種類及含量相對較多，有6種有機酸和41種揮發性風味物質被檢測出來，其中有機酸中草酸、乳酸含量較高，揮發性成分中乙酸乙酯、1-異硫代氰酸丁酯、乙醇、二甲基二硫、二甲基三硫相對含量較高，是構成泡菜風味的主要組成部分，與自然發酵泡菜相比，人工接種發酵泡菜中風味物質的種類更多，相對含量更高，無論是從感官評定還是含量分析中均能得出人工接種發酵泡菜優于自然發酵泡菜，此研究為接種功能菌對泡菜風味的影響奠定了基礎，對在工業上提升泡菜發酵工藝具有重要的意義。

[1]徐丹萍，蒲彪，卓志航，等.傳統泡菜中乳酸菌對風味的影響[J].食品與發酵工業，2014,40(2)：170-173.

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EffectofFunctionalBacteriaontheFormationofFlavorSubstancesinPickles

CHEN Zhuo, HUANG Dan*, YU Hua, TANG Jiao, LUO Xue, MAO Xiang, TANG Ping

(College of Bioengineering, Sichuan University of Science and Engineering, Zigong 643000, China)

UseLactobacillusplantarumand yeast isolated from natural fermented pickles as functional bacteria to strengthen the production of pickles' fermentation, and the effect of functional bacteria on the formation of flavor substances in pickles is studied.The organic acids and volatiles in fermented pickles are detected and analyzed by high performance liquid chromatography with headspace solid phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry.The effects of different inoculation amount of yeast on the flavor compounds of pickled are also studied.The results show that when the inoculation amount of yeast is 0.5%, the flavor substances of the pickles are more, the natural fermented pickles are very different from artificial inoculated functional bacteria fermented pickles in flavor. The types and levels of pickles' flavor substances in different fermentation time and inoculation amount are also different. And 6 kinds of organic acids and 41 kinds of volatile components are detected in the fermentation process, the content of oxalic acid and lactic acid in organic acid is high, the relative content of esters, alcohols, phenols and dimethylsulfides in volatile components is higher. They are the characteristic flavor ingredients of the white radish pickles.

pickles；functional bacteria；organic acid；volatile components

TS255.54

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.12.014

1000-9973(2017)12-0066-05

2017-06-15 *通訊作者

四川省重點實驗室基金項目(2015GTY010)；四川省富順縣科技創新基金項目(201512)

陳卓(1991-)，男，山東濟寧人，碩士，主要從事固態釀造功能微生物方面的研究；

黃丹(1968-)，女，教授，主要從事微生物及應用方面的研究。