襄陽大頭菜腌制液生物膜真菌多樣性研究

趙慧君，沈馨，董蘊，吳競，凌霞，胡事成，郭壯*

(1.湖北文理學(xué)院 化學(xué)工程與食品科學(xué)學(xué)院 鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽 441053； 2.襄陽市食品藥品檢驗所，湖北 襄陽 441021；3.襄陽孔明菜有限公司，湖北 襄陽 441000)

襄陽大頭菜腌制液生物膜真菌多樣性研究

趙慧君1，沈馨1，董蘊1，吳競2，凌霞2，胡事成3，郭壯1*

(1.湖北文理學(xué)院 化學(xué)工程與食品科學(xué)學(xué)院 鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽 441053； 2.襄陽市食品藥品檢驗所，湖北 襄陽 441021；3.襄陽孔明菜有限公司，湖北 襄陽 441000)

采集了3 個襄陽大頭菜腌制液生物膜樣品，使用Miseq高通量測序技術(shù)對其真菌微生物群落結(jié)構(gòu)進行了解析。在門水平上，Ascomycota平均含量高達99.99%，相對含量大于1%的真菌屬分別為Zygosaccharomyces，Pichia和Candida，其平均相對含量分別為56.10%，40.96%和2.32%。在分類操作單元(operational taxonomic units，OTU)水平上，發(fā)現(xiàn)24 個核心OTUs，其中OTU62(Zygosaccharomyces)和OTU37(Phialosimplex)的累計平均相對含量為83.60%。由此可見，襄陽大頭菜生物膜中的真菌微生物主要由隸屬于Ascomycota的Zygosaccharomyces和Pichia構(gòu)成，生物膜共有大量的核心真菌菌群。

襄陽大頭菜；生物膜；真菌；多樣性；Miseq

作為我國四大名腌菜之一的襄陽大頭菜是以芥菜為原料，采用獨特的“三腌、五鹵、六曬”工藝歷時18個月腌制而成，該制作工藝至今已有近2000年的歷史。因具有口感脆嫩、香味濃郁和歷史悠久的特點，2007年襄陽大頭菜被列為中國國家地理標(biāo)志產(chǎn)品，2009年又被列為湖北省非物質(zhì)文化遺產(chǎn)[1]。襄陽大頭菜的腌制主要在腌制池或缸中進行，長達18個月的腌制過程實質(zhì)上是微生物發(fā)酵、食鹽高滲透壓和蛋白質(zhì)分解等一系列生化反應(yīng)協(xié)同作用的結(jié)果，該過程賦予了大頭菜獨特的風(fēng)味和口感[2]。然而襄陽大頭菜的生產(chǎn)總體處于粗放式加工狀態(tài)，由于雨水和塵土等因素的影響，腌制池或缸表面會形成一層白色的生物膜。隨著生物膜的出現(xiàn)，大頭菜的脆度明顯降低且產(chǎn)生刺激性氣味，最終導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)下降直至失去經(jīng)濟價值。雖然將生物膜撈出后大量添加食鹽可以暫時延緩這一現(xiàn)象的再次發(fā)生，但生物膜一經(jīng)形成就很難控制和去除[3]。

16S rRNA和18S rRNA基因測序技術(shù)作為系統(tǒng)遺傳學(xué)和微生物生態(tài)學(xué)的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”方法[4]，長期應(yīng)用于環(huán)境樣品微生物群體的物種組成和豐度研究中。以Miseq為代表的高通量測序技術(shù)采用宏基因組學(xué)的研究策略，通過將環(huán)境樣品中微生物的基因組混合作為一個整體進行研究，不僅揭示了微生物群體的物種組成及豐度信息，亦可以解析物種的生物功能，打破了傳統(tǒng)微生物學(xué)基于純培養(yǎng)研究的局限性[5]。

本項目以表面長生物膜大頭菜腌制液為研究對象，從宏基因組層面，以真菌18S rRNA基因全長為Miseq測序靶點，在各系統(tǒng)分類學(xué)地位上對生物膜的真菌群落結(jié)構(gòu)進行了揭示，以期為后續(xù)因產(chǎn)生生物膜而導(dǎo)致襄陽大頭菜品質(zhì)下降這一產(chǎn)業(yè)化問題的解決提供數(shù)據(jù)支持和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

QIAGEN DNeasy mericon Food Kit：購于德國QIAGEN公司；dNTPs Mix，5×TransStartTM，F(xiàn)astPfu Buffer和FastPfu Fly DNA Polymerase：購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA 1000 試劑盒：購于美國Agilent公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5810R臺式高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng) 美國BIO-RAD公司；ND-2000C微量紫外分光光度計 美國Nano Drop公司；vetiri梯度基因擴增儀 美國AB公司；DYY-12電泳儀 北京六一儀器廠；2100芯片生物分析儀 美國Agilent公司；Miseq高通量測序平臺 美國Illumina公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的采集

從湖北省襄陽孔明菜有限公司的腌制缸中采集長生物膜的大頭菜腌制液樣品3份。樣品采集時，首先使用組織搗碎機將生物膜與腌制液攪拌均勻，然后立即置于4 ℃采樣箱內(nèi)，運送回實驗室后置于-80 ℃冷凍儲存，48 h內(nèi)完成DNA的提取。

1.3.2 DNA提取

大頭菜腌制液3000 g 離心10 min后收集菌體，采用QIAGEN DNeasy mericon Food Kit試劑盒提取微生物宏基因組DNA，繼而使用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計對DNA的濃度和純度進行測定，符合后續(xù)試驗要求的DNA保存在-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 真菌18S rRNA擴增

PCR擴增體系為：5×PCR緩沖液4 μL，2.5 m MdNTPs mix 2 μL，5 μmol/L正向引物0.8 μL，5 μmol/L反向引物0.8 μL，5 U/μL DNA聚合酶0.4 μL，DNA模板10 ng，體系用ddH2O補充至20 μL。其中真菌18S rRNA正向引物為SSU0817F(5'-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3')，其反向引物為SSU1196R(5'-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3')，且在正向引物中加入7個核苷酸標(biāo)簽(barcode)。

擴增條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗合格后，置-20 ℃冰箱備用。

1.3.4 樣品平衡及Miseq高通量測序

使用2100芯片生物分析儀將每個樣品的DNA模板稀釋至100 nmol/L，混合均勻后寄往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司使用Miseq平臺進行高通量測序。

1.3.5 序列的拼接及質(zhì)控

按照以下流程進行序列的拼接：根據(jù)成對序列之間的重疊關(guān)系，將雙端序列數(shù)據(jù)拼接成一條序列；根據(jù)barcode將所有序列劃分到各個樣品并對序列方向進行校正；切掉序列barcode和引物。

若在序列拼接過程中存在以下情況則將該序列予以剔除：重疊區(qū)的堿基數(shù)小于10 bp；重疊區(qū)的最大錯配比率大于0.2；barcode堿基錯配；引物堿基錯配數(shù)大于2 bp；切掉barcode和引物后若序列堿基數(shù)小于50 bp亦予以剔除。

1.3.6 生物信息學(xué)分析

使用QIIME(v1.7.0)分析平臺[6]對過控合格的序列按照以下流程進行物種分析：

采用PyNAST[7]軟件將序列對齊；

以100%的相似度用UCLUST軟件[8]劃分序列得到無重復(fù)單一序列集，建立分類操作單元(operational taxonomic units，OTU)；

以97%相似性使用UCLUST軟件進一步劃分OTU；

從每條OTU選取1 條代表性序列，使用SILVA[9,10]數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得門、綱、目、科、屬和OTU水平上各真菌的分類信息；

使用 FastTree 軟件[11]繪制基于 OTU 代表序列的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，計算香農(nóng)指數(shù) (Shannon index)、Observed Species(發(fā)現(xiàn)物種數(shù))和超 1 指數(shù) (Chao1 index)，進而對襄陽大頭菜腌制液生物膜alpha多樣性進行計算。

1.3.7 核酸登錄號

本研究中所有Miseq序列數(shù)據(jù)已提交至MG-RAST數(shù)據(jù)庫，ID號為mgp79759。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列豐富度和多樣性分析

納入本研究的3 個腌制液生物膜樣品18S rRNA測序情況及各分類地位數(shù)量見表1。

表1 樣品18S rRNA測序情況及各分類地位數(shù)量Table 1 Sample 18S rRNA sequencing and the number of taxonomic status

注：計算每個樣品Chao1和Shannon指數(shù)時，樣品的測序量均為30010條序列。

由表1可知，通過Miseq高通量測序，本研究采集的3 個樣品共產(chǎn)生了101882 條高質(zhì)量16S rRNA序列，平均每個樣品產(chǎn)生33961 條。經(jīng)過100%序列鑒定聚類分析后，本研究共得到16833 條代表性序列，根據(jù)序列的97%相似性進行操作分類單元劃分后，共得到93 個OTU，每個樣品平均51 個OTU。進一步使用稀疏曲線和香農(nóng)指數(shù)曲線對本研究產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量是否滿足后續(xù)生物信息學(xué)分析進行了評價，其結(jié)果見圖1。

圖1 稀疏曲線圖(A)和香農(nóng)指數(shù)曲線圖(B)Fig.1 Sparse curve (A) and Shannon index curve (B)

由圖1可知，隨著測序量的增加，稀疏曲線未進入平臺期(A)而香農(nóng)指數(shù)曲線進入了平臺期(B)，這說明隨著測序量的增加，新的種系型可能會被發(fā)現(xiàn)，但微生物的群落結(jié)構(gòu)不會再發(fā)生改變了，由此可見，本研究產(chǎn)生的序列數(shù)是可以滿足后續(xù)生物信息學(xué)分析要求的。

2.2 基于不同分類地位核心菌群相對含量的分析

本研究使用SILVA數(shù)據(jù)庫對OTU代表性序列進行了同源性比對，所有的序列鑒定為2 個門、6 個綱、7 個目、8 個科和12 個屬，僅有0.006%的序列不能鑒定到屬水平。其中MBZ1和MBZ2樣品中僅發(fā)現(xiàn)Ascomycota這1 個真菌門，在MBZ3樣品中除Ascomycota外，亦發(fā)現(xiàn)了Basidiomycota，但其相對含量僅為0.0063%。由此可見，襄陽大頭菜生物膜中的真菌微生物主要隸屬于Ascomycota。如果某一真菌屬在3 個樣品中的平均相對含量大于1.0%，則將其定義為優(yōu)勢真菌屬。不同樣品中優(yōu)勢真菌屬相對含量的比較分析見圖2。

圖2 襄陽大頭菜腌制液生物膜中優(yōu)勢真菌屬相對含量的比較分析Fig.2 Comparative analysis of the relative content of dominant fungi in the biomembrane of pickled liquid in Xiangyang

由圖2可知，納入本研究的3個腌制液生物膜樣品中優(yōu)勢真菌屬分別為Zygosaccharomyces，Pichia和Candida，其相對含量分別為56.10%，40.96%和2.32%，其他9個屬的相對含量累計為0.62%。由此可見，襄陽大頭菜生物膜中的真菌微生物主要由隸屬于Ascomycota的Zygosaccharomyces和Pichia構(gòu)成。徐婷等使用YPD培養(yǎng)基，采用純培養(yǎng)的方法從長有生物膜的襄陽大頭菜鹵水中分離了1株酵母菌，并將其鑒定為Zygosaccharomycesrouxii。值得一提的是，經(jīng)文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)，在泡菜[12]和葡萄酒[13]等發(fā)酵食品的制作過程中亦有生物膜現(xiàn)象的出現(xiàn)，類似的問題同樣影響了上述食品行業(yè)的發(fā)展。饒瑜等[14]對泡菜生物膜中真菌進行了分離，研究表明Pichiakluyveri可以導(dǎo)致生物膜的形成。由此可見，Zygosaccharomyces下的真菌種可能具有致生物膜產(chǎn)生的作用。

如果某一個真菌屬在3個樣品中均存在，則本研究將其定義為核心菌屬，襄陽大頭菜腌制液生物膜中核心真菌屬的構(gòu)成及含量見圖3。

圖3 襄陽大頭菜腌制液生物膜中核心真菌屬的構(gòu)成及含量分析Fig.3 Analysis of the composition and content of core fungi in the biomembrane of pickled liquid in Xiangyang

由圖3可知，Zygosaccharomyces，Pichia和Candida既為優(yōu)勢屬又為核心屬，除此之外，Phialosimplex亦為核心屬，其相對含量為0.60%。本研究進一步統(tǒng)計了OTU在3個樣品中出現(xiàn)的次數(shù)，其結(jié)果見圖4。

圖4 OTU在襄陽大頭菜腌制液生物膜樣品中出現(xiàn)次數(shù)統(tǒng)計Fig.4 The number of times of occurrence of OTU in the samples of biomembrane of pickled liquid in Xiangyang

由圖4可知，3個襄陽大頭菜腌制液生物膜樣品共產(chǎn)生93個OTU，然而在3個樣品中僅出現(xiàn)1 次的OTU為56個，占OTU總數(shù)的60.22%，所包含序列數(shù)為530條，占所有質(zhì)控后合格序列數(shù)的0.52%。本研究每個樣品平均產(chǎn)生33960條序列，而每個樣品中僅出現(xiàn)1次的OTU平均每個含有9.5條序列，則每個僅出現(xiàn)1次的OTU其包含序列的平均相對含量僅為0.028%。基于OTU水平的Venn圖見圖5。

圖5 基于OTU水平的Venn圖Fig.5 Venn diagram based on OTU level

由圖5可知，MBZ1和MBZ2共有5個OTUs和21條序列，MBZ1和MBZ3共有4 個OTUs和60 條序列，MBZ2和MBZ3共有4 個OTUs和218條序列。雖然納入本研究的3個襄陽大頭菜生物膜樣品中共發(fā)現(xiàn)24個真菌的核心OTUs，占OTU總數(shù)的25.81%，但其包含101053條序列，占所有質(zhì)控后合格序列數(shù)的99.19%。由此可見，雖然有的襄陽大頭菜腌制液生物膜樣品中可能含有一些較為獨特的種系型，但其相對含量是極低的，因而樣品共有大量的核心真菌菌群，核心OTU在3個襄陽大頭菜生物膜樣品中相對含量的熱圖見圖6。

圖6 核心OTU在各襄陽大頭菜腌制液生物膜樣品中相對含量的熱圖Fig.6 Heat map of the relative content of core OTU in biomembrane of pickled liquid in Xiangyang

注：依據(jù)OTU的進化關(guān)系建立了左側(cè)的系統(tǒng)發(fā)育樹。

由圖6可知，24個OTUs中，15個隸屬于Zygosaccharomyces，各有3 個隸屬于Pichia，Phialosimplex和Candida。值得一提的是，OTU62(Zygosaccharomyces)在3個樣品中的相對含量高達54.02%，51.23%和24.14%，而OTU37(Phialosimplex)相對含量高達33.07%，24.59%和63.74%，2個OTU的累計相對含量分別為87.09%，75.82%和87.88%，這也進一步證實了雖然襄陽大頭菜腌制液生物膜樣品共有大量的核心真菌菌群，但核心真菌菌群的多樣性相對較低，2個OTUs的相對含量就占到了真菌類群的80%左右。本研究進一步對核心屬和核心OTU之間的相關(guān)性進行了分析，其結(jié)果見圖7。

圖7 核心屬和平均相對含量大于1.0%的核心OTU相關(guān)性的熱圖Fig.7 Heat map of correlation among the core fungi genera (A) and OTU with relative content more than 1.0% (B)

注：依據(jù)相關(guān)系數(shù)建立左側(cè)和頂端聚類樹。

由圖7可知，4個核心真菌屬之間相關(guān)性均不顯著(P>0.05)，除OTU62(Zygosaccharomyces)和OTU37(Phialosimplex)外，OTU86(Candida)的平均相對含量也大于1.0%，然而3 個OTU之間亦均無相關(guān)性(P>0.05)。

3 結(jié)論

襄陽大頭菜生物膜中的真菌微生物主要由隸屬于Ascomycota的Zygosaccharomyces和Pichia構(gòu)成，雖然有的樣品中可能含有一些較為獨特的種系型，但生物膜樣品共有大量的核心真菌菌群。

[1]馮曉霞.襄陽大頭菜向品牌化發(fā)展[J].光彩，2013，20(8)：40-41.

[2]王金美.大頭菜新工藝及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究[D].重慶：西南大學(xué)，2010.

[3]徐婷，張成杰，張桂敏.襄陽孔明菜鹵水中耐鹽污染菌的分離與鑒定[J].湖北大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2013，35(1)：24-28.

[4]Thomas V，Clark J，Doré J.Fecal microbiota analysis：an overview of sample collection methods and sequencing strategies[J].Future Microbiology，2015，10(9)：1485-1504.

[5]Oihonomou G，Machado V S，Santisteban C，et al.Microbial diversity of bovine mastitic milk as described by pyrosequencing of metagenomic 16S rDNA[J].Plos One，2012，7(10)：1-14.

[6]Caporaso J G，Kuczynski J，Stombaugh J，et al.QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data[J].Nature Methods，2010，7(5)：335-336.

[7]Caporaso J G，Bittinger K，Bushman F D，et al.PyNAST：a flexible tool for aligning sequences to a template alignment[J].Bioinformatics，2010，26(2)：266-267.

[8]Edgar R C.Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST[J].Bioinformatics，2010，26(19)：2460-2461.

[9]Quast C，Pruesse E，Yilmaz P，et al.The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools[J].Nucleic Acids Research，2012，41(1)：590-596.

[10]Yilmaz P，Parfrey L W，Yarza P，et al.The SILVA and "all-species living tree project (LTP)" taxonomic frameworks[J].Nucleic Acids Research, 2014，42(1)：643-648.

[11]Price M N，Dehal P S，Arkin A P.Fasttree：computing large minimum evolution trees with profiles instead of a distance matrix[J].Molecular Biology and Evolution，2009，26(7)：1641-1650.

[12]韓珍瓊，劉金成，程道梅.泡菜懸浮膜的特性研究及防治措施初探[J].食品工業(yè)科技，2011，33(8)：232-235.

[13]Tristezza M，Lourenco A，Barata A，et al.Susceptibility of wine spoilage yeasts and bacteria in the planktonic state and in biofilms to disinfectants[J].Annals of Microbiology,2010，60(3)：549-556.

[14]饒瑜，常偉，龔麗，等.四川泡菜生花酵母的分離與鑒定[J].食品與發(fā)酵科技，2013，49(3)：19-22.

StudyontheDiversityofFungalMicrofloraofBiomembraneinXiangyangMustardRootBrine

ZHAO Hui-jun1, SHEN Xin1, DONG Yun1, WU Jing2, LING Xia2, HU Shi-cheng3, GUO Zhuang1*

(1.Northwest Hubei Research Institute of Traditional Fermented Food, College of Chemical Engineering and Food Science, Hubei University of Arts and Science, Xiangyang 441053, China; 2.Xiangyang Institute of Food and Drug Supervision, Xiangyang 441021, China; 3.Xiangyang Kongmingcai Co.,Ltd ., Xiangyang 441000, China)

In the current study, 3 biomembrane samples of Xiangyang mustard root brine are collected, and the fungal microbiota are studied by Miseq high throughput sequencing technologies.Ascomycotais the most dominant fungal phylum with the relative abundance of 99.99%. At the phylum level,Zygosaccharomyces,PichiaandCandidaare constituting more than 1% of total sequences, with the relative abundance of 56.10%, 40.96% and 2.32% respectively. At the OTU level,24 OTUs are shared by all samples, and the cumulative average relative content of OTU62(Zygosaccharomyces)and OTU37(Phialosimplex)is 83.60%. The results indicate that the fungal microbiota of biomembrane in Xiangyang mustard root brine are main consisted byZygosaccharomycesandPichiabelong toAscomycota, and biomembrane samples have a large number of core fungal flora.

Xiangyang mustard root；biomembrane；fungus；diversity；Miseq

TS255.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.12.013

1000-9973(2017)12-0061-05

2017-07-15 *通訊作者

湖北省食品藥品監(jiān)督管理局科研項目(201601025)；襄陽市科技計劃研究與開發(fā)項目(2016)；湖北文理學(xué)院食品新型工業(yè)化學(xué)科群建設(shè)項目(2017)

趙慧君(1979-)，女，講師，博士，研究方向：食品生物技術(shù)；

郭壯(1984-)，男，副教授，博士，研究方向：食品生物技術(shù)。