豆瓣辣醬高酶活霉菌篩選及豆醅促熟性研究

但茜，毛佳怡，曾海英

(貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴陽 550025)

豆瓣辣醬高酶活霉菌篩選及豆醅促熟性研究

但茜，毛佳怡，曾海英*

(貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴陽 550025)

以豆瓣辣醬微生物區系中已分離鑒定的5株優勢霉菌M2～M6為試驗菌株，通過篩選高產蛋白酶和肽酶菌株，并將之應用于發酵豆醅，對比傳統發酵以探索其在縮短周期、促進風味及提高品質等方面的應用可行性。研究表明：M3產蛋白酶活力達到139.49 U/mL；M6肽酶活力達1.039 mg/dL。采用高酶活菌株進行人工接種菌群強化發酵蠶豆，促熟效果顯著，發酵時間縮短至20天(傳統周期為60～90天)，M3組呈味氨基酸含量達56.63%，M6組為48.03%，而傳統優質CK組僅為45.23%，差異顯著(P<0.05)。

豆瓣辣醬；高蛋白酶；高肽酶；促熟；風味

1 概述

近年來，由于人們保健意識逐漸提升，發酵食品因其高營養價值和生理功能，尤其是具有濃郁醬香和醇厚鮮美口感的豆瓣醬受到越來越多消費者的喜愛[1]。然而傳統豆瓣辣醬成熟周期長、品質不穩定，已逐漸成為制約豆瓣辣醬產業發展的瓶頸，故生產過程中的促熟、增香、提高營養價值日益成為產業發展擬待解決的問題。微生物能使豆瓣辣醬發酵時間縮短、提高豆瓣辣醬營養價值等作用使其越發受人追捧[2-4]，因此，通過篩選高酶活菌株并且研究其特性，再應用篩選后的高酶活菌株到產品中從而使豆瓣辣醬達到促熟、增香、提高品質等目的是本研究的意義所在。

2 材料與方法

2.1 試驗材料與儀器

2.1.1 試驗材料

試驗菌種：試驗選用的5株霉菌均系貴州大學食品免疫與毒理評價實驗室從豆瓣辣醬制品中分離而來的具有益酵益生作用的優勢菌種，編號分別是M2平革菌科(Porostereumcrassum)，M3雜色曲霉(Aspergillusversicolor)，M4蠟葉枝孢霉(Cladosporiumsphaerospermum)，M5桔青霉(Penicilliumcitrinum)，M6阿姆斯特丹曲霉(Eurotiumamstelodami)，所有菌種使用前均進行活化、純檢；發酵成熟豆瓣。

2.1.2 主要試劑

三氯乙酸、Na2CO3、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、干酪素、NaOH、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基、脫脂奶粉、水合茚三酮試劑。

2.1.3 主要培養基

牛奶培養基：脫脂奶粉2.5 g、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基0.401 g、蒸餾水100 mL，分裝，經115 ℃ 20 min滅菌，備用。

蠶豆粉液體培養基：蠶豆粉3 g、葡萄糖0.8 g、蒸餾水100 mL。

馬鈴薯葡萄糖液體培養基：去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1000 mL，分裝，經121 ℃ 20 min滅菌，備用。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基：取本品40.1 g，加蒸餾水1000 mL，加熱煮沸至完全溶解，分裝，經121 ℃ 20 min滅菌，備用。

2.1.4 主要設備

PSHP-250型智能生化培養箱 上海光都儀器設備有限公司；CJ-1D超凈工作臺 天津市泰斯特儀器有限公司；TGL20M臺式高速冷凍離心機 長沙邁佳森儀器設備有限公司。

2.2 試驗方法

2.2.1 菌種活化及擴大培養

將菌種接種于蠶豆培養基中，(29±1) ℃條件下培養3～4天，使霉菌充分生長，反復轉接2～3次后，可將退化及衰老的細胞除去，使菌種達到生長旺盛、菌活量高的對數期。通過對菌株的反復連續培養，使菌體中保持原有典型性狀的單細胞恢復原有菌株典型性狀，可繼續傳代擴大培養[5]。

2.2.2 待測酶液制備

將種子液接種于蠶豆培養基中，搖床參數設定180 r/min，30 ℃培養48 h后轉移至50 mL離心管中于4 ℃，10000 r/min條件下離心5 min，收集上清液，置于4 ℃冰箱中保存備用。

2.2.3 高產蛋白酶菌株的篩選

2.2.3.1 平板透明圈法[6]初篩選出具有產蛋白酶能力的菌株

用接種環刮取1環試驗菌株孢子到裝液量20 mL/100 mL的大豆培養基中，設定參數30 ℃，180 r/min，培養48 h。制備牛奶培養基，取發酵液10 mL，5000 r/min離心10 min，然后取上清液100 μL加入到初篩平板點樣孔中，28 ℃培養48 h后，比較水解圈大小[7]。所有試驗均設3組平行。

2.2.3.2 Folin-酚法復篩確定高產蛋白酶菌株

根據SB/T 10317-1999，稍做修改。

2.2.3.3 酪氨酸標準曲線的制作

準備6支無菌試管并編號，按表1調配不同濃度標準的酪氨酸溶液。

表1 酪氨酸標準曲線的制作Table 1 The making of standard curve of tyrosine

取16支干燥無菌的試管編號，將表1中配制的各濃度酪氨酸溶液分別取1 mL，分別加入0.4 mo1/mL Na2CO3溶液5 mL、Folin試劑溶液1 mL后，置于(40±2) ℃水浴中恒溫20 min。

在波長660 nm處，以0號試管為對照空白，測定吸光度。

建立回歸方程，計算出當吸光度為1時的酪氨酸的量(μg)，即為吸光常數K值。

2.2.3.4 蛋白酶活力的測定

取待測酶液1.0 mL于20 mL刻度管中，(40±2) ℃預熱5 min，加入1.0 mL 2%酪蛋白溶液，于(40±2) ℃準確反應10 min后，加2.00 mL 0.4 mo1/L TCA溶液終止反應，搖勻后10000 r/min離心10 min，再取上清液1 mL于試管中，相繼加入5 mL 0.4 mo1/L Na2CO3溶液，1 mL Folin-酚試劑稀釋液，混勻后于(40±2) ℃水浴中顯色20 min，加蒸餾水定容至20 mL。

空白對照：先在樣品中加入TCA使酶失活，再加入酪蛋白溶液，以后操作步驟參考上述方法。

在660 nm波長下測定OD值。

“古道”則是用典，用了《咸陽別李處士》“古道自迢迢，咸陽離別橋。”典故。古道是分別的最后一站，牽手走過的地方注定是預示著分別的存在，這使歌曲充滿了離愁別緒，牽手走過的道路也成為了離別的道路，這使歌曲充滿了戲劇化的魅力。

對蛋白酶活力的規定：1 mL酶液在40 ℃時1 min水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸量，將此定義為1個酶活力單位(U)。

粗酶液的蛋白酶活力(U)=(OD1-OD2)×K×V×N/t。

式中：OD1為樣品的吸光度值；OD2為空白對照的吸光度值；V為反應試劑總體積；N為稀釋倍數；t為反應時間；K為由酪氨酸標準曲線求出的吸光常數，本試驗所求的K=97。

2.2.4 高產肽酶菌株篩選[8]

2.2.4.1 亮氨酸標準曲線的測定

取8支20 mL具塞刻度試管并編號，參照文獻中操作步驟加入各種試劑，蓋上玻璃塞，混勻。再在100 ℃水浴中加熱15 min(加熱時封口)，取出后立即置于冷水中迅速冷卻。然后迅速向每管中加入5 mL 95%乙醇，塞好塞子，猛搖試管，此時溶液呈紫色。然后用60%乙醇稀釋至20 mL，以0號管為參比進行調零，于570 nm波長處測定溶液的吸光度，重復3次，然后繪制標準曲線，求出線性方程。

2.2.4.2 肽酶活力測定反應體系

取待測酶液1 mL，加入質量濃度2 g/dL的無菌大豆肽溶液1 mL，置于3 mL pH 7.5的Tris-HCl緩沖液中反應過夜，最后取反應液1 mL，測定其中游離氨基酸總量。

2.2.4.3 反應體系中游離氨基酸總量計算[9]

游離氨基酸總量(mg/dL)=(m1×V)/(Vs×m×1000)×100。

式中：m1為從標準曲線查得的氨基酸的質量(μg)；V為樣品提取液總體積(mL)；Vs為測定時所取樣品液體積(mL)；m為樣品質量(g)。

2.2.5 氨基酸態氮含量測定

參照GB/T 5009.40-2003規定的方法測定。

2.2.6 游離氨基酸測定

本試驗是測定發酵成熟的豆醅中游離氨基酸，選用了LC-20AT高效液相色譜儀測定；測定依據為GB/T 16631-2008《高效液相色譜法通則》。

3 結果分析

3.1 高酶活菌株篩選

3.1.1 高產蛋白酶菌株篩選

牛奶平板蛋白酶初篩結果見圖1。

圖1 牛奶平板蛋白酶初篩結果Fig.1 The initial screening results of protease by milk plate count method

將粗酶液置于牛奶平板上過夜培養，除M4無明顯產酶能力外，4株均顯示出具有產蛋白酶的能力。

按照2.2.3所述方法測定吸光值，并繪制標準曲線，見圖2。可知酪氨酸標準曲線回歸方程為y=0.0103x-0.00129。

圖2 酪氨酸標準曲線Fig.2 The standard curve of tyrosine

由圖3可知，M3菌株產蛋白酶活力與其余產蛋白酶菌株活力存在顯著差異，菌株M3蛋白酶活力最強，為139.49 U/mL。

3.1.2 高產肽酶菌株篩選

亮氨酸標準曲線見圖4，利用一元線性回歸方程分析得到亮氨酸標準曲線回歸方程為y=0.181x+0.015，相關系數R2=0.9998，表明亮氨酸與OD570之間線性回歸比較顯著，可用于以大豆肽粉為底物測定菌株產肽酶活力。

圖4 亮氨酸標準曲線Fig.4 The standard curve of leucine

圖5 菌株產肽酶酶活力Fig.5 Strains' producing peptidase enzyme activity

由圖5可知，試驗菌株均具有產肽酶能力，但能力大小存在差異，總肽酶活力上菌株M6產肽酶能力最強，為1.039 mg/dL，M2次之，為0.928 mg/dL，其余菌株產肽酶能力均弱于這2株。

結合高產蛋白酶菌株篩選結果，確定高產肽酶菌株為M6，并對菌株M3，M6進行菌株性能評定及應用。

3.2 豆醅促熟性研究

3.2.1 豆醅氨基酸態氮含量測定

表2 氨基酸態氮含量Table 2 Amino acid nitrogen content

氨基酸態氮指以氨基酸形式存在的氮元素含量，是判定發酵產品發酵程度的特性指標，含量越高，鮮味越好。由表2可知，M6菌株強化菌群組氨基酸態氮的含量最為突出，含量高達0.748 g/100 g，在發酵過程中利用了更多的底物，使之分解為游離氨基酸，提高豆醅品質。

3.2.2 豆醅游離氨基酸測定

表3 游離氨基酸含量表Table 3 Table of free amino acid content

表4 呈味氨基酸含量表Table 4 Table of flavor amino acid content

注：-表示未檢出。

決定豆瓣辣醬風味的氨基酸主要為苯丙氨酸(Phe)、天冬氨酸(Asp)、絲氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)及酪氨酸(Tyr)，由表3和表4可知，傳統優質CK組豆醅中的呈味氨基酸為77.682 mg/g，占總氨基酸的45.23%；加M3菌組豆瓣辣醬中的呈味氨基酸為82.9488 mg/g，占總氨基酸的56.63%；加M6菌組豆瓣辣醬中的呈味氨基酸為67.801 mg/g，占總氨基酸的48.03%。可知菌群強化對于風味氨基酸的產出是有利的，所占比重均比傳統優質CK組值大，這說明2株高產酶菌株對風味有著明顯改善作用。

4 結論與討論

4.1 結論

對從豆瓣辣醬微生物區系中篩選且已鑒定的5株霉菌菌株M2～M6進行高產蛋白酶菌株及高產肽酶菌株的篩選，結果表明：菌株M3產蛋白酶能力明顯，菌株M6產肽酶能力突出，因此確定這2株菌為目標菌株，進行引用。

將菌株應用于發酵中，使發酵豆醅成為菌群強化實驗組，與傳統優質CK強化組比較，可明顯看出2株高酶活菌株具有一定的促熟、增香作用。且2株高酶活菌株應用于發酵后，產品理化指標均有部分優化，這表明高酶活菌株應用于生產上是切實可行的，具有優勢。

4.2 討論

本試驗所得結論證實了高酶活菌株對豆醅發酵起到促進作用的預想，且證明了高酶活菌株應用于產品中確實能改善產品風味，提高產品營養價值。但是，菌株如何高效使用和菌株的保存，以及工業化生產還是擬待解決的問題。同時，菌株的安全性測試還應該繼續完善。傳統工藝與現代科學技術的完美結合將是今后努力追求的目標。

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[3]Wanakhachornkrai P,Lertsiri S.Comparison of determination method for volatile compounds in Thai soy sauce[J].Food Chemistry,2003,83(4):619-629.

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ScreeningofHighEnzymeActivityStrainsfromBeanChiliSauceandResearchonRipeningPromotionofBeanFermentedGrains

DAN Qian, MAO Jia-yi, ZENG Hai-ying*

(College of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

Take the five dominant moulds M2～M6 separated and identified from microflora of bean chili sauce as test strains, screen high-yield protease and peptidase strains and apply them for fermenting bean fermented grains, in order to explore the application feasibility of shortening fermentation period, promoting flavor and improving quality compared with the traditional fermentation. The protease activity of M3 reaches 139.49 U/mL and the peptidase activity of M6 reaches 1.039 mg/dL. The fermentation time is shortened to 20 days (the traditional fermentation period is 60～90 days). The content of amino acid in M3 group is 56.63% and that in M6 group is 48.03%.At the same time, that of the traditional high-quality CK group is only 45.23%, the difference is significant (P<0.05).

bean chili sauce；high proteinase；high peptidase；ripening promotion；flavor

TS264.29

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.12.010

1000-9973(2017)12-0050-04

2017-06-12 *通訊作者

曾海英(1978-)，女，貴州貴陽人，副教授，研究方向：食品發酵與安全。