EMA實時熒光PCR技術檢測食品中單核增生李斯特活菌方法研究

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EMA實時熒光PCR技術檢測食品中單核增生李斯特活菌方法研究

張俊彥，梅玲玲，徐昌平，占利，陳鴻鵠，張云怡，陳建才，張政，楊勇

目的利用疊氮溴化乙錠(EMA)實時熒光PCR技術，建立直接檢測食品中單增李斯特活菌的方法。方法根據單核李斯特菌inlA基因設計特異性引物和探針。用不同EMA濃度、不同光照次數優化樣品前處理條件。用平板計數法驗證該方法的檢出限及對死菌的抑制率。用35株單增李斯特菌、25株非單核李斯特菌、92株非李斯特菌驗證該方法特異性。用添加了不同劑量的單增李斯特死菌、活菌及金黃色葡萄球菌的15件飲料，15件熟肉制品進行模擬實樣檢測。結果單增李斯特活菌EMA實時熒光PCR方法的Ct=(38.46-3.30)×log(菌量)(R2=0.999)。最低檢測的活菌濃度為55 cfu/反應。對死菌DNA抑制效率≥ 99.98%。35株單增李斯特菌Ct值最低16.21，最高29.38，而25株非單單增李斯特菌、92株非單增李斯特菌的Ct值均大于35或無Ct值。重復試驗Ct值變異系數小于5%。30件模擬實樣單增李斯特菌的檢測結果與常規方法完全一致。且EMA實時熒光PCR方法檢出時間僅需10 h左右，而常規分離培養方法需要5～7 d。結論EMA實時熒光PCR檢測技術是一種快速、簡便、特異性強、靈敏度高、僅檢測單增李斯特菌活菌的有效方法，可作為食品中檢測單增李斯特活菌的方法推廣使用。

單增李斯特菌；活菌；疊氮溴化乙錠(EMA)；實時熒光PCR技術

單核細胞增生李斯特菌可引起新生兒、老年人和免疫缺陷病人腦膜炎、敗血癥，孕婦流產等疾病，死亡率高達20%～30%。該菌主要通過食物傳播[1-3]。近年來，因該菌引發疾病所導致死亡和孕婦流產的報道有所增加[4]。已引起國內食品安全專家的關注。

常規的食品中單增李斯特菌分離鑒定方法，需要進行2次增菌，用選擇性培養基分離，進行生化鑒定，整個過程需要1周以上，并且由于培養基的敏感性、生化反應的穩定性欠佳等因素，對單增李斯特菌的檢出率、準確性帶來了極大挑戰。近年來，應用普通PCR、實時熒光PCR等分子生物學快速檢測單增李斯特菌技術時有報道[5-8]。但是，食品加工后多數細菌已死亡，DNA核酸卻仍保留，造成PCR結果的假陽性，由此限制了實時熒光PCR檢測技術在食品單增李斯特菌檢測中的使用。死細胞的細胞膜能夠被疊氮溴乙錠(EMA)穿過，并且細胞的DNA在光激活的作用下能與EMA結合。結合了疊氮溴乙錠的DNA無法進行PCR擴增，從而避免了PCR結果中出現假陽性問題[9-10]。本文通過將實時熒光PCR技術與EMA相結合，建立了一種食物中單增李斯特活菌檢測方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗菌株 單增李斯特菌(CMCC 54001、CMCC 54002、CMCC 54003、CMCC 54004、CMCC 54005)、格氏李斯特菌(ATCC25401)、無害李斯特菌(ATCC33090)、伊凡諾夫李斯特菌(ATCC19119)、威爾遜李斯特菌(ATCC35897)、金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)、表皮葡萄球菌(ATCC12228)、糞鏈球菌(CMCC32001)、蠟樣芽胞桿菌(ATCC11778)、乙型溶血性鏈球菌(CMCC32210)、枯草芽胞桿菌(ATCC63501)、腸炎沙門菌(ATCC50041)、大腸埃希氏菌(ATCC25922、8099)、副溶血性弧菌(ATCC17802、ATCC33653)、擬態弧菌(ATCC33847)分別購自中國生物制品檢定所、中國微生物菌種保藏中心；本實驗室從食品或病人糞便標本分離的菌株:單核增生李斯特菌30株、英諾克李斯特菌13株、莫氏李斯特菌5株、威氏李斯特菌3株、金黃色葡萄球菌20株、蠟樣芽胞桿菌20株、副溶血性弧菌10株、大腸埃希氏菌10株、沙門菌10株、志賀菌10株。

1.1.2引物和探針 選擇單核李斯特菌inlA基因保守序列(登錄號HQ111554.1)，用DNAMAN 7.0軟件設計探針和特異性引物(Primer Express 3.0軟件設計)。在探針3′端用淬滅熒光染料BHQ1標記,5′端用報告熒光染料6-Carboxyfluorescein(FAM) 標記。委托寶生物工程(大連)有限公司合成引物和特異性探針。引物和熒光探針序列見下：上游引物(inlAF)5′-AAC ATC AGT CCC CTA GCA GGT TT-3′；下游引物(inlAR)5′-TTC CAG CTG ATT TTC ATT AAG CTC TA-3′；熒光探針(inlApb)5′-FAM-ACC GCA CTC ACT ACC-BHQ1-3′

1.1.3試劑和儀器；PCR反應試劑(DRR039S)購自寶生物工程(大連)有限公司；疊氮溴乙錠(EMA)購自美國Biotium公司；所有培養基均購自北京陸橋技術股份有限公司，經質量驗收合格后，在有效期內使用;7500 Fast 實時熒光定量PCR系統(美國ABI life technology公司產品)。

1.2 方法

1.2.1光作用次數和EMA作用濃度的選擇方法 取0.5麥氏濃度的單增李斯特菌(CMCC 54001)懸液，90 ℃加熱10 min滅活，分裝至1.5 mL EP管，每管200 μL，共計18管。按EMA終濃度為0 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL、25 μg/mL，光作用(放置黑暗處,時間8 min，650 W鹵素燈,光照8 min)1次、2次、3次作矩陣配比處理后，用生理鹽水洗3次后，沉淀加200 μL TE緩沖液懸浮，置沸水浴20 min，-20 ℃以下冰箱凍融1次，10 000 r/min離心5 min后，吸取上清作為DNA模板,進行實時熒光PCR檢測。同步選擇同濃度EMA及光作用條件，對同濃度單增李斯特活菌進行光處理和實時熒光PCR檢測。取對死菌的擴增效率最低，而對活菌擴增效率影響最小的EMA作用濃度和光作用次數作為最佳EMA作用條件。

1.2.2EMA實時熒光PCR方法 模板DNA制備：對于菌培養物：可直接挑取1～2菌落至200 μL TE緩沖液。若為食品樣品，則需稱或吸取25 g(mL)到225 mL李斯特增菌液(LB1)中，36 ℃±1 ℃ 增菌8 h 后，各吸1 mL，離心，沉淀加200 μL TE 緩沖液溶解。然后，均按最佳EMA作用條件處理后，沸水浴20 min，-20 ℃以下凍融1次，10 000 r/min離心5 min，吸取上清液作為模板DNA。

反應體系：10 μL 2×Premix Ex TaqTM，各0.4 μL上、下游引物(濃度10 μmol/L)，0.8μL探針(濃度10 μmol/L)，3.0 μL模板DNA，5.4 μL ddH2O，共20 μL。

反應條件： 95 ℃預變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火40 s，40個循環。在退火溫度處設定熒光檢測點。熒光檢測模式選擇FAM熒光，閾值線的設定選在剛好超過正常陰性對照的最高點, 如果Ct值≤35,且待測樣品的熒光增長曲線超過設定的閾值線且對數增長良好，判定為陽性。陰性判定依據為Ct值gt;35或無Ct值。

1.2.3最低檢出限及對死菌抑制率檢測 取0.5麥氏單位單增李斯特菌(CMCC 54001)懸液1.0 mL，用10倍梯度稀釋成100～10-78種濃度，各取200 μL，進行EMA實時熒光PCR擴增。同時用血瓊脂按平板涂布計數法進行菌濃度計數，結果0.5麥氏單位單增李斯特菌(CMCC 54001)濃度為1.8×108cfu/mL。經換算用作檢測的8種菌濃度分別為5.4×105cfu /反應、5.4×104cfu /反應、5.4×103cfu /反應、5.4×102cfu /反應、5.4×101cfu /反應、5.4 cfu /反應、5.4×10-1cfu /反應、5.4×10-2cfu /反應。以確定方法的最低檢出限。

對死菌DNA抑制率試驗及計算方法:同步取同濃度經90 ℃作用15 min的單增李斯特死菌，按相同的方法進行EMA實時熒光PCR擴增，確定方法對死菌DNA抑制率;將用此方法擴增測得的死菌的Ct值，用上述用活菌檢測所得的Ct值與反應濃度線性公式計算，得出死菌經EMA處理后DNA擴增濃度。該檢測方法對死菌DNA的抑制效率由[1-(EMA處理后死菌的DNA擴增濃度/死菌濃度)]×100計算得出。

1.2.4特異性驗證 為驗證方法的特異性,對以下菌株的菌懸液進行EMA實時熒光PCR擴增:5株單核李斯特菌標準株、30株單核李斯特菌分離株、13株英諾克李斯特菌、5株莫氏李斯特菌、4株威氏李斯特菌、1株格氏李斯特菌、1株無害李斯特菌、1株伊凡諾夫李斯特菌、21株金黃色葡萄球菌、21株蠟樣芽胞桿菌、12株大腸桿菌、12株副溶血性弧菌、11株腸炎沙門菌、10株志賀菌、1株表皮葡萄球菌、1株糞鏈球菌、1株乙型溶血性鏈球菌、1株枯草芽胞桿菌、1株擬態弧菌。

1.2.5重復性驗證 計算重復試驗的Ct值的變異系數來驗證方法的重復性, 反應Ct值由隔天連續5次對以下進行EMA實時PCR檢測得到,包括單增李斯特菌標準菌株(CMCC 54001)1株、單增李斯特菌分離株2株、沙門菌(CMCC 50013)1株和大腸埃希菌標準株(ATCC 25922)1株。

1.2.6模擬樣品檢測 取熟肉制品和飲料各15份，分別稱或吸25 g(mL)到225 mL李斯特增菌液(LB1)中，所有樣品中添加了英諾克李斯特氏菌(菌濃度約為105cfu/mL), 其中在每類樣品中，5份樣品未添加單增李斯特菌, 2份既添加死的單增李斯特菌(菌濃度均約為104cfu/mL)、又添加活的單增李斯特菌(菌濃度均約為103cfu/mL), 4份添加死的單增李斯特菌(菌濃度均約為104cfu /mL)，4份添加活的單增李斯特菌(菌濃度分別約為10 000 cfu/mL、1 000 cfu /mL、100 cfu /mL、10 cfu /mL)。按《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 單增細胞增生李斯特氏菌檢驗》(GB 4789.30-2010)方法對上述加標樣品進行單增李斯特菌分離鑒定。同步36 ℃±1 ℃培養8 h后，各吸1 mL，進行EMA實時熒光PCR擴增。以驗證2種檢測方法是否一致。

2 結 果

2.1EMA作用濃度和處理次數優化結果 將EMA終濃度為25 μg/mL、20 μg/mL、15 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL、0 μg/mL，光處理(黑暗處放置8 min，650 W鹵素燈光照8 min)1次、2次、3次進行矩陣配比設計成18種排列組合，對同一種濃度單增李斯特菌死菌、活菌進行EMA實時熒光PCR檢測結果，經EMA處理的15個組合，死菌的Ct值從23.13～35.91，并且隨著EMA濃度和光處理次數增加不斷提升，死菌Ct值不斷增大，即對死菌DNA抑制效率不斷提升，但提升效率EMA濃度明顯高于光處理次數(表1)。綜合考慮EMA對死菌、活菌DNA的影響以及工作效率，最終本研究選擇最佳條件為25 μg/mL的EMA終濃度，光處理1次(黑暗處放置,8 min，650 W鹵素燈光照8 min)。

2.2最低檢出限檢測結果 分別用8種濃度分別為5.4×105cfu /反應、5.4×104cfu /反應、5.4×103cfu /反應、5.4×102cfu /反應、54 cfu /反應、5.4 cfu /反應、5.4×10-1cfu /反應、5.4×10-2cfu /反應濃度單增李斯特菌菌培養物進行EMA實時熒光PCR擴增，結果Ct值和待測菌濃度對數有良好的線性關系，Ct=(38.46-3.30)×log(菌量)，相關系數(R2)為0.999(圖1-A)。方法的最低檢測濃度為54 CFU/反應(圖1-B)。

表1 EMA作用濃度和處理次數優化結果(Ct值)
Tab.1 Optimization of EMA concentration and irradiating times

光處理次數(次)Irradiatingtimes(time)EMA終濃度(μg/mL)EMAterminalconcentration(μg/mL)05101520251死菌Inactivatedstrains19．6620．4022．7525．2229．0231．19活菌Alivestrains19．3519．5719．6219．6319．6819．712死菌Inactivatedstrains19．3723．1326．1129．1731．9735．64活菌Alivestrains19．5619．4819．5019．8220．1220．443死菌Inactivatedstrains19．4524．7427．3330．3833．4336．16活菌Alivestrains19．3920．7221．8522．2122．6922．97

圖1 單增李斯特菌EMA實時熒光PCR檢測技術敏感性檢測結果Fig.1 Detection susceptibility of EMA real-time fluorescence PCR method for Listeria monocytogenes

2.3對死菌抑制率檢測結果 分別用以下8種單增李斯特菌死菌濃度為5.4×105cfu /反應、5.4×104cfu /反應、5.4×103cfu /反應、5.4×102cfu /反應、5.4×101cfu /反應、5.4 cfu /反應、5.4×10-1cfu /反應、5.4×10-2cfu /反應的培養物進行EMA實時熒光PCR檢測，結果均判定為陰性,Ct值在26.36到無Ct值(呈一條線)。用Ct=(38.46-3.30)×log(菌量)計算出擴增濃度，計算結果上述濃度的死菌DNA均被有效抑制,抑制率大于等于99.98%(表2)。

表2 不同條件下對單增李斯特菌熒光定量PCR技術檢測結果
Tab.2 Detection results of L.monocytogenes by using EMA real-time fluorescence PCR under different conditions

Lm菌濃度(cfu/反應)Lmconcentration(cfu/reaction)5．4×1055．4×1045．4×1035．4×102545．40．054Ct值Ctvalue31．3835．75-----實際擴增濃度(cfu/反應)Amplicationconcentration(cfu/re?action)1416．600000對死菌抑制率(%)Inhibitionrateofinactivatedstrains99．9999．98100100100100100

注：-表示無Ct值

Note: - means not detected

2.4特異性驗證結果 對35株單增李斯特菌、13株英諾克李斯特菌、5株莫氏李斯特菌、4株威氏李斯特菌、1株格氏李斯特菌、1株無害李斯特菌、1株伊凡諾夫李斯特菌、92株其他非李斯特菌菌懸液，菌懸液進行EMA實時熒光PCR擴增結果顯示，35株單增李斯特菌Ct值最低16.21，最高29.38，而25株其他李斯特菌、92株其他非李斯特菌的Ct值均大于35或無Ct值(呈一條線)。圖2為部分菌株的擴增結果。

圖2 單增李斯特菌EMA實時熒光PCR檢測技術特異性檢測結果Fig.2 Results of detection specificity for L. monocytogenes by using EMA real-time fluorescence PCR

2.5單增李斯特菌EMA實時熒光PCR檢測技術重復性驗證結果 隔天連續重復5次進行EMA實時PCR檢測單增李斯特菌標準菌株(CMCC 54001)、單增李斯特菌分離株2株、沙門菌(CMCC 50013)1株和大腸埃希菌標準株(ATCC 25922)1株,結果如表3所示。由表3可見， 3種陽性菌和1種陰性菌Ct值的變異系數均lt;5%, 1種陰性菌部分結果無Ct值,無法計算其變異系數,結果顯示陽性菌和陰性菌均能夠正確判定。

2.6模擬樣品檢測結果 對30件模擬樣品的檢測結果顯示, EMA實時熒光PCR檢測和常規分離培養法結果完全一致,在每類樣品中，添加了活的單增李斯特菌的6份樣品檢測結果均為陽性，其中4份樣品添加了不同濃度的單增李斯特活菌，2份樣品同時添加了單增李斯特活菌和死菌。其余樣品則兩種方法的檢測結果均為陰性。

3 討 論

單增李斯特菌是引起食物中毒并可在免疫受損的個體中導致嚴重疾病的食源性病原菌。九十年代以來，在美國、日本和歐洲等國由此菌造成的臨床疾病和食物污染程度已大大超過了沙門氏菌。在33屆世界食品法典委員會會議上已將此菌列為四大食源性致病菌之一。許多國家已將其作為進口食品必檢菌。《食品安全國家標準 食品中致病菌限量》(GB 29921-2013)標準中也規定肉制品中單增李斯特菌不得檢出。目前食品中單增李斯特菌檢測方法主要有分離培養、酶聯免疫法、PCR方法等。分離培養是基于表型測試,可操作性強、操作簡單、成本低，但檢驗周期較長、特異性低，檢測食品中單增李斯特菌不夠及時、快速、靈敏。酶聯免疫法特異性低，且操作不便。常規的PCR反應敏感快速，但無法鑒定區分活菌和死菌[7-10]。而食品中加工過程中已經死亡的單增李斯特菌的DNA卻能在食品中保留很長時間，但PCR檢測結果此時仍為陽性。因此，在加工食品中直接采用PCR方法檢測，存在假陽性的風險。

表3 EMA實時熒光PCR技術重復性檢測結果
Tab.3 Repepition assay for EMA real-time fluorescence PCR

菌株名稱(Strains)Ct1Ct2Ct3Ct4Ct5Ct(平均)sCV(%)Lm標準菌(CMCC54001)LmStandardstrainCMCC5400117．3417．2317．4517．8817．2717．370．241．38Lm分離株(14?W?04)Lmisolate14?W?0417．9318．0018．5719．1218．3818．400．432．34Lm分離株(14?W?27)Lmisolate14?W?2719．4218．2919．3020．1019．7319．620．613．11沙門菌(CMCC50013)SalmonellaCMCC5001335．6335．9636．2136．2236．4336．090．270．75大腸埃希菌(ATCC25922)EscherichiacoliATCC2592236．12-------

注：-表示無Ct值Note: - means not detected.

EMA能夠穿過死細胞的細胞膜，并且在光激活的作用可以和細胞的DNA結合，使死菌DNA無法進行PCR擴增，這樣就可以避免PCR結果中出現假陽性[9-10]。本文將操作簡便、結果敏感、特異的實時熒光PCR技術與EMA相結合，建立一種快速并且有效的檢測單增李斯特菌的方法。

本次研究結果顯示，單增李斯特菌EMA實時熒光PCR檢測技術Ct值與檢測菌對數值呈較好的線性關系，相關系數(R2)為0.999。方法的靈敏度高，最低檢測菌的濃度為54 cfu/反應，特性性強，對非李斯特菌金黃色葡萄球菌、臘樣芽胞桿菌、非單增李斯特菌英諾克、莫氏李斯特氏菌的循環域值(Ct值)均可判定為陰性(大于35或無Ct，Ct值變異系數均lt;5%)，且對死菌DNA能有效抑制，抑制率≥99.98%。對30件飲料或熟肉模擬樣品的加標檢測結果顯示, EMA實時熒光PCR檢測和常規分離培養法結果結果完全一致。且單增李斯特菌EMA實時熒光PCR檢測技術簡便、快速，且僅檢測食品中的單增李斯特活菌，因此，這對將實時熒光PCR等DNA快速檢測技術直接應用于檢測食品中單增李斯特菌具有重要意義。

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NewEMAreal-timefluorescencePCRmethodfordetectionofaliveListeriamonocytogenesinfoods

ZHANG Jun-yan, MEI Ling-ling, XU Chang-ping, ZHAN Li, CHEN Hong-hu, ZHANG Yun-yi, CHEN Jian-cai, ZHANG Zhen, YANG Yong

(DepartmentofMicrobiology,ZhejiangProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Hangzhou310051,China)

A new EMA real-time fluorescence PCR method was developed to detect aliveListeriamonocytogenesin foods. The specific primers and probe were designed based on the conservedinlAgene. The pretreatment conditions including EMA of different concentrations and irradiating times were optimized. The detection limit and inhibition rate to dead bacteria of this method were confirmed by using direct plating method. The detection specificity was evaluated by using 35L.monocytogenesstrains, 25 non-L.monocytogenesstrains and 92 non-Listeriastrains. Simulation detection experiments were performed on 15 beverage samples and 15 cooked meat samples supplemented separately with inactivatedL.monocytogenes, aliveL.monocytogenesandStaphylococcusaureus. Results showed that the Ct of EMA real-time fluorescence PCR for aliveL.monocytogeneswas Ct=38.46-3.30×log (R2=0.999). The detection limit was 55 cfu per reaction. Inhibition rate of DNA of inactivated strains was over 99.98%. The Ct of 35L.monocytogenesstrains were between 16.21 and 29.38, while 25 non-L.monocytogenesstrains and 92 non-Listeriastrains had Ct gt;35. The variation coefficient of CT was less than 5% when the experiments were repeated. Results of 30 simulation samples were consistent with that by using standard method. The test time by using newly developed EMA real-time fluorescence PCR was shortened from 3-5 days to about 10 h. The newly developed EMA real-time fluorescence PCR method for aliveL.monocytogenesis rapid, convenient, specific and sensitive and could be applyed in foods inspection.

Listeriamonocytogenes; alive bacteria; EMA; real-time fluorescence PCR

Mei Ling-ling, Email: llmei@cdc.zj.cn

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.11.011

浙江省公益類科技計劃項目(No.2015C37058)與浙江省醫藥衛生科技計劃項目(No.2016KYB065)聯合資助

梅玲玲，Email：llmei@cdc.zj.cn

浙江省疾病預防控制中心，杭州 310051

R378.99

A

1002-2694(2017)11-1007-06

Supported by the Public Welfare Technology and Application Project of Zhejiang Province (No.2015C37058), the Medical Scientific Research Foundation of Zhejiang Province (No.2016KYB065)

2017-05-05編輯王曉歡