海洋芽孢桿菌中Iturin A分離鑒定研究性實驗教學探索

丁唯嘉，周丹麗，陳 敏，宋高鵬，楊卓鴻，李春遠

(華南農業大學 a.材料與能源學院； b.公共基礎課實驗教學中心, 廣州 510642)

·實驗教學與創新·

海洋芽孢桿菌中IturinA分離鑒定研究性實驗教學探索

丁唯嘉a，周丹麗a，陳 敏b，宋高鵬a，楊卓鴻a，李春遠a

(華南農業大學 a.材料與能源學院； b.公共基礎課實驗教學中心, 廣州 510642)

以一株海洋Bacillussp.細菌為對象，進行天然藥物化學研究性實驗的教學探索。通過優化菌株發酵條件、改進文獻提取分離純化方案，高效率地分離純化出目標產物Iturin A，并指導學生綜合運用質譜，1HNMR結合文獻調研鑒定產物結構。該實驗合理使用制備高效液相色譜儀，液質聯用儀、核磁共振儀等大型儀器設備，改進了傳統天然藥物化學實驗內容，實現了學生實驗中微量天然產物快速、高效、可視化的分離與純化。實驗有助于激發學生學習興趣，使其全面深刻地認識微生物天然產物的科學研究流程，了解掌握不同大型儀器的應用范圍和操作技術，提升操作技能和創新能力。

研究性實驗； 天然藥物化學； 海洋微生物； 芽孢桿菌

0 引 言

天然藥物化學是運用現代科學技術和方法研究天然產物活性成分的學科[1]，是中藥學、藥學、制藥工程、應用化學等藥學或化學類相關專業本科或碩士研究生的一門專業課。其配套課程天然藥物化學實驗主要包括天然產物有效成分提取、分離和結構鑒定等內容[2]。然而，目前國內各高校開設的天然藥物成分提取分離實驗主要以陸生植物為對象，缺乏關于微生物或海洋天然產物的實驗內容，與教材中增設的海洋天然產物章節及有關微生物代謝產物的知識內容有所脫節[3-5]。另一方面，隨著大型儀器的普及、更新及新儀器的出現，天然藥物化學的科研流程逐漸走向微量化、高速化和可視化[6-8]，而目前的天然產物成分提取分離學生實驗較少使用制備高效液相儀、液質聯用儀等大型設備，缺乏對新技術、新方法的介紹和應用，不利于符合社會需求的創新性人才的培養。伊枯草菌素(Iturin)是由芽孢桿菌產生的一類大環脂肽類化合物，其中Iturin A含量相對較高，包括8種化合物，具有強烈抗真菌活性，且低毒、抗菌譜廣，在醫藥，多種農作物病害防治和果蔬保鮮方面有較高的應用價值[9-11]。鑒于以上原因，在課題組科研項目的基礎上，本文設計了一則以一株分離自湛江海岸泥沙的Bacillussp.ms12為對象快速分離純化Iturin A的研究性實驗，該實驗綜合運用了液質聯用儀、制備高效液相儀、核磁共振儀等大型儀器設備和多種天然藥物化學常規實驗操作，有利于培養學生的實驗技能、創新能力和綜合運用知識從事科學研究的能力，促進學生對天然藥物化學新技術和相關章節知識更加全面深刻的認識。

1 優化菌株發酵條件

為提高學生實驗的效率，提前采用正交法優化確定了菌株Bacillussp.ms12的發酵條件：葡萄糖10 g/L，蛋白胨20 g/L，NaCl 7 g/L，K2HPO45 g/L，蒸餾水1 L，pH 7.0，28℃下以200 r/min搖床振蕩培養7 d。在此條件下菌株發酵1 L所得Iturin A化合物的量可順利完成核磁共振和質譜測試。同時發酵時間也適合學生研究性實驗開設的周期要求。

2 提取、分離及純化方法的探索與優化

2.1采用大孔吸附樹脂DM301進行提取

早期報道Iturin A化合物提取主要采用飽和硫酸銨溶液鹽沉淀法[12]，需靜置過夜析出沉淀，且沉淀需經過透析除鹽步驟，耗時較長。現在實驗室主要采用酸沉淀法，需將發酵液加HCl調pH到2后過夜沉淀，再將沉淀用甲醇懸浮，NaOH調pH到中性，甲醇多次萃取得到提取物[13]。然而對于學生實驗而言，該方法等待沉淀時間仍然偏長，難以合理分配教學時間。近幾年有研究表明，Iturin A在S-8，AB-8等6種不同極性大孔樹脂中均能被完全吸附，其中以DM301的解吸效果相對最好[14]。預實驗結果與上述報道基本符合，因此，從學生實驗時效性考慮，采用了大孔吸附樹脂DM301提取法代替了酸或堿提取法。

2.2超聲波輔助動靜態解吸結合對大孔樹脂吸附物進行粗分離

文獻報道，使用無水乙醇可使大孔吸附樹脂中Iturin A的解吸率達到90%以上[14]。然而直接使用無水乙醇洗脫會導致樹脂中所吸附的糖類等大極性化合物與Iturin A一起解吸，影響后續分離純化工作，因此，有必要增加解吸劑極性段進行粗分離。預實驗表明，40%乙醇水混合溶劑對發酵液中Iturin A 基本沒有解吸作用，因此，實驗先采用該溶劑洗去無關物質后再用無水乙醇解吸出Iturin A粗產物。同時，在解吸過程中采用先將飽和樹脂置于三角瓶中超聲波輔助靜態解吸，再使用布氏漏斗進行抽濾和動態解吸的方法[15]，不僅大大提高了解吸速度和效率，而且所消耗溶劑也只有普通靜態或動態解吸方法的1/3左右。

2.3液質聯用指導下使用制備高效液相色譜進行IturinA純化

制備高效液相色譜儀具有上樣量大、不破壞樣品、分離速度快、分離效能高、檢測器靈敏度高且分離過程可視化等優點。本實驗中，Iturin A類似物多，產量低且分子量大，在低發酵量時采用常規分離方法很難得到純品。因此，使用制備高效液相色譜儀進行純化成為首選。Iturin A的制備液相純化條件可使用分析型液相色譜進行摸索。在缺乏標準品對照的情況下，設計了使用液相色譜質譜聯用(LCMS)摸索純化條件的方法，所得LC色譜見圖1[LCMS液相色譜條件為C18色譜柱 (Diamonsil, 5 μm, 150×2.0 mm)，20%乙腈水—100%乙腈梯度洗脫，洗脫時間25 min，檢測波長215 nm, 流速1 mL/min]。使用液質聯用儀配套軟件依次查看每個色譜峰所對應的質譜峰，發現Iturin A系列化合物的分子量出現在保留時間13.2和13.6 min左右的兩個吸收峰處，對應質譜圖分別見圖2和圖3。

圖1 LCMS測試所得的HPLC圖

圖2 LCMS的HPLC譜中tR=13.2 min對應的化合物(Iturin A2)的質譜圖

圖3 LCMS的HPLC圖中tR=13.6 min對應的化合物(Iturin A5)的質譜圖

通常制備柱上樣量和分析柱上樣量的比值和兩者柱徑比值的平方成正比，兩者流速或流量也滿足相同的關系[16]。因此，根據實驗室已有的制備柱，計算出后續純化所用制備液相分離的流速和上樣量，成功通過制備液相在和LCMS接近的保留時間處純化得到兩個Iturin A系列的單體化合物。所得化合物質譜圖分別和圖2及圖3一致。

3 質譜、核磁共振氫譜與文獻調研結合鑒定所得化合物結構

目前，Iturin A 系列化合物絕大多數是通過質譜方法進行鑒定的[17]，故可引導學生通過文獻質譜調研嘗試結構解析。學生通過查閱文獻，發現Iturin存在 Iturin A1、A2和 A6 3個同系物，m/z分別為 1 029.5, 1 043.5 和 1 071.5，而m/z為 1 057.5 可能是 Iturin A3、A4或 A5的同系物，它們三者的m/z相同，通過質譜分析很難將它們區分開[18]。由此學生通過圖2質譜分子離子峰1 043.6[M+H]+、 1 065.6[M+Na]+很快確定液相中保留時間13.2 min處吸收峰所對應的化合物為Iturin A2(結構式見圖5)。另一個化合物的鑒定還需要通過核磁共振氫譜(1HNMR)輔助進行，用0.5 mL氘代二甲基亞砜將其溶解，加入核磁管中，加塞。將核磁管插入轉子，用量規使處于合適高度后，放入核磁共振儀，經進樣，勻場、鎖場、采樣等操作命令后可得其1HNMR譜，見圖4。

在分析圖譜之前，先組織學生根據文獻調研得到的Iturin A3、A4和A5的結構式(見圖5)進行對比討論，從積分高度與質子數、化學位移數值與官能團、裂分與偶合情況關系等預測它們核磁共振氫譜可能的不同之處。學生經過對比得出結論：Iturin A3的甲基信號應該是積分為6的三重峰和二重峰疊加；Iturin A4的甲基信號應該是積分為6的二重峰；Iturin A5的信號則應該是積分為3的三重峰。再進一步與圖4所測HNMR對比，發現0.74～0.87的甲基具有三重峰，由此確定所得另一個化合物的結構為Iturin A5。至此，實驗得到圓滿成功，共分離鑒定了為Iturin A2 和A5兩個純凈的單體化合物。

圖4 所分離化合物(Iturin A5，LCMS中保留時間13.6 min的吸收峰)1HNMR譜

IturinA-2R=(CH2)11CH3
IturinA-3R=(CH2)8CH(CH3)CH2CH3
IturinA-4R=(CH2)9CH(CH3)2
IturinA-5R=(CH2)11CH3

圖5 Iturin A2、A3、A4和A5的結構式

4 結 語

當前各高校的天然藥物化學實驗均偏重植物有效成分的提取分離，而忽視了微生物活性代謝產物的研究，不利于學生全面理解掌握天然藥物化學各類不同對象的不同研究方法。產生上述問題的主要原因在于微生物需要人工發酵培養，代謝產物種類復雜繁多且產量低，從而導致實驗工作量大，分離純化相對困難等。針對這些問題，本文依托于自身科研項目，精選所需發酵量少，發酵時間短的Bacillussp.細菌為對象，分離其具有強烈抗真菌活性的主要產物Iturin A，通過優化菌株發酵條件、改進文獻提取分離純化方案，高效率地分離純化出目標產物，并指導學生綜合運用質譜，1HNMR結合文獻調研鑒定產物結構。實驗有助于激發學生學習興趣，使其全面深刻地認識微生物天然藥物化學的科學研究流程，提升操作技能和創新能力。另一方面，目前國內許多高校各類大型儀器設備已初步實現了普及，如何使大型儀器設備在本科實驗教學中充分發揮作用已成為高等學校急需面對的重要現實課題[19]。在此形勢下，根據自身設備條件，合理改革傳統天然藥物化學實驗內容，運用制備高效液相色譜儀，液質聯用儀、核磁共振儀等大型儀器設備，實現了學生實驗中微量天然產物快速、高效、可視化的分離與純化。實驗使學生掌握了相關大型儀器的應用范圍和操作技術，對其更好地適應當今社會科技高速發展的現狀，提升就業能力起到了積極作用。實驗所積累的Iturin A是目前抗植物病原真菌農藥研究的熱點化合物，后續可以作為大學生科技創新訓練計劃項目的原料，衍生出新的創新內容。

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TeachingExplorationofaResearchExperimentfortheIsolationandIdentificationofIturinAfromaMarineBacillussp.

DINGWeijiaa,ZHOUDanlia,CHENMinb,SONGGaopenga,YANGZhuohonga，LIChunyuana

(a.College of Materials and Energy； b.Center of Experimental Teaching for Basic Courses;South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

A research experiment of natural medicinal chemistry was designed by using a Bacillus sp.which belongs to marine bacteria.The target was efficiently to isolate product Iturin A by optimizing fermentation conditions, improving the methods of extraction and separation presented in previous references.Moreover, under teachers’ guidance the structures of the product were elucidated by the students using MS,1HNMR and document investigation.In this experiment, the large-scale instruments including preparative HPLC spectrometer, LCMS spectrometer, and NMR spectrometer were reasonably used and the traditional teaching contents in natural medicinal chemical experiments werere formed.The fast, efficient and visual separation and purification of micro-scale natural products was achieved in the experiment.The experiment helps students to enhancethe interest of study, deepen the understanding of the scientific research procedures of marine microbial natural product chemistry, grasp the application scope and operation technology of these large-scale instruments, and improve the operating skill and innovation ability.

research experiments; natural medicinal chemistry; marine microorganism;bacillus

G 642.0

A

1006-7167(2017)10-0173-04

2016-08-29

國家自然科學基金(21102049)；廣東省自然科學基金(2015A030313405)；廣東省科技計劃公益研究與能力建設專項基金(2016A020222019)；教育部留學回國人員科研啟動基金([2015]311)；廣東省高等學校教學質量與教學改革工程項目(GDJG20142098)；廣東省高等教育學會實驗室管理專業委員會基金項目(GDJ2014069)；華南農業大學教育教學改革與研究項目(JG16060，JG10109)；廣東省大學生科技創新訓練計劃資助項目(201610564225)

丁唯嘉(1979-)，女，河南周口人，博士，講師，主要從事應用化學研究。Tel.:15919670749; E-mail:dwjzsu@scau.edu.cn

李春遠(1978-)，男，河南扶溝人，博士，教授，主要從事天然產物化學研究。Tel.:13570598356; E-mail:chunyuan-li@163.com