冬凌草甲素對人腦膠質瘤細胞株U251殺傷、增殖及NF-κB蛋白表達的影響

苑鶴毅，王麗敏，劉君，林大勇，劉鴻，白劍,4，張麗艷

(1遼寧中醫藥大學實驗動物中心， 沈陽110847；2 遼寧中醫藥大學附屬醫院；3 遼寧省中醫藥研究院臨床藥理室；4中國人民解放軍第三〇九醫院器官移植研究所)

冬凌草甲素對人腦膠質瘤細胞株U251殺傷、增殖及NF-κB蛋白表達的影響

苑鶴毅1，王麗敏2，劉君3，林大勇1，劉鴻1，白劍1,4，張麗艷1

(1遼寧中醫藥大學實驗動物中心， 沈陽110847；2 遼寧中醫藥大學附屬醫院；3 遼寧省中醫藥研究院臨床藥理室；4中國人民解放軍第三〇九醫院器官移植研究所)

目的觀察冬凌草甲素對人腦膠質瘤細胞株U251殺傷、增殖及NF-κB蛋白表達的影響。方法將濃度為10、20、40、80 μmol /L 冬凌草甲素與U251細胞(實驗組)分別孵育，同時設不加冬凌草甲素培養的U251細胞作對照組，分別于不同時間點計數U251、計算冬凌草甲素對U251細胞的IC50、測算U251細胞增殖抑制率、檢測U251細胞中的NF-κB蛋白。結果與對照組相比，實驗組加入40 、80 μmol /L的冬凌草甲素后U251細胞數明顯減少(P均lt;0.05)。冬凌草甲素作用24、48 、72 h時對U251細胞的IC50分別為82.2、65.3、44.1 μmol /L。與20 μmol /L冬凌草甲素相比，40、80 μmol /L冬凌草甲素作用48、72 h時的細胞增殖抑制率明顯降低(P均lt;0.05)。與對照組相比，40、80 μmol /L的冬凌草甲素作用48、 72 h時，U251細胞中NF-κB蛋白的相對表達量明顯降低(P均lt;0.05)。結論冬凌草甲素在體外可殺傷人腦膠質瘤細胞株U251，抑制其增殖，下調其NF-κB蛋白的表達；冬凌草甲素對U251細胞的殺傷、增殖抑制作用可與其對NF-κB信號通路發揮調節作用有關。

冬凌草甲素；腦膠質瘤；細胞生長；細胞增殖；NF-κB信號通路；NF-κB蛋白

人腦膠質瘤是顱內常見的侵襲性腫瘤之一，呈浸潤生長，與周圍腦組織界限不清，惡性度高，手術切除后易復發，患者發病后存活期短、病死率高，平均存活時間1.5 a[1，2]。在對切除的人腦膠質瘤組織進行病理檢查過程中發現NF-κB信號通路的異常活化在腦膠質瘤的發生和發展過程中發揮了重要作用[3，4]。冬凌草甲素為唇形科香茶菜屬植物冬凌草干燥品的提取物，其主要成分為以貝殼杉烯為骨架的四環二萜類化合物[5]。有研究[6]發現，冬凌草甲素在體內和體外對人源性和動物源性腫瘤細胞的生長均具有明顯抑制作用，其作用機制與抑制NF-κB蛋白表達有關。2016年10月1日～2017年4月30日，我們觀察了不同濃度的冬凌草甲素對人腦膠質瘤細胞株U251殺傷、增殖及NF-κB蛋白表達的影響。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 藥品、細胞及試劑 冬凌草甲素純品購自上海詩丹德生物技術有限公司。人腦膠質瘤細胞株U251購自北京鼎國昌盛生物科技有限公司。RPMI1640培養液購自美國Gene公司；Hyclone小牛血清購自美國Thermo scientific公司； NF-κB(p-P65)和α-Tublin抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology 公司；二抗購自中杉金橋公司；MTT、臺盼藍和1.25%胰酶購自美國Sigma-Aldrich公司；其余分析純試劑購自國藥集團遼寧分公司。

1.2 冬凌草甲素對U251細胞的殺傷情況觀察及IC50計算 將處于對數生長期的U251細胞消化后接種于96 孔板，并對細胞進行計數，每孔細胞數為1 ×104個，待細胞貼壁后，實驗組分別在每孔加入含10、20、40 、80 μmol /L冬凌草甲素的無血清培養基，每個濃度設5個復孔，對照組加入不含冬凌草甲素的無血清培養液，在37 ℃、5% CO2培養箱中繼續培養并在第24、48、72 h時分別用1.25%的胰酶消化，臺盼藍染色并對每孔內的細胞進行計數，以5個復孔細胞數的平均值繪制生長曲線，計算24、48 、72 h 時冬凌草甲素對U251細胞的IC50。

1.3 冬凌草甲素對U251細胞增殖的影響觀察 將處于對數生長期的U251細胞消化后接種于96 孔板，并對細胞進行計數，每孔細胞數為1 ×104個，待細胞貼壁后，實驗組分別于每孔加入含10、20、40、80 μmol /L 冬凌草甲素的無血清培養基，每個濃度設5個復孔，對照組加入不含冬凌草甲素的無血清培養液，在37 ℃、5% CO2培養箱中繼續培養24、48、72 h。在MTT實驗前用PBS清洗2次，加入5 mg /mL的MTT 20 μL并繼續培養4 h，棄去上清液后，每孔加入DMSO 150 μL，并置搖床15 min。調整酶標儀波長至 490 nm處，測算光密度值(OD值)，并計算細胞生長抑制率。細胞生長抑制率= [(對照組OD值-實驗組OD值) /對照組OD值]×100%。

1.4 冬凌草甲素對U251細胞NF-κB蛋白表達的影響觀察 將處于對數生長期的U251細胞消化后接種于6孔板，實驗組分別加入10、20、40、80 μmol/L的冬凌草甲素，對照組不加冬凌草甲素，分別于培養48、72 h時收集部分細胞，用蛋白裂解液裂解后收集到1.5 mL的 EP管中，煮沸5 min后12 000 r/min離心1 min，棄上清備檢。BCA法進行NF-κB蛋白定量檢測：向SDS-PAGE凝膠中加入樣本，電泳分離后電轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，加入NF-κB(1∶1 000)和α-Tublin(1∶1 000)抗體4 ℃孵育過夜后，加入二抗37 ℃孵育30 min。采用凝膠成像分析系統，通過各條帶的灰度值計算NF-κB蛋白的相對表達量。

2 結果

2. 1 冬凌草甲素對U251細胞的殺傷情況及IC50各時間點實驗組、對照組U251細胞計數比較見表1。由表1可見，實驗組加入10、20μmol /L的冬凌草甲素后U251細胞數無明顯變化，加入40 、80 μmol /L的冬凌草甲素后U251細胞數明顯減少。冬凌草甲素作用24、48 、72 h時對U251細胞的IC50分別為82.2、65.3、44.1 μmol /L。

表1 各時間點實驗組、對照組U251細胞計數比較(個

注：與對照組相比，*Plt;0.05。

2.2 冬凌草甲素對U251細胞增殖的影響 加入不同濃度冬凌草甲素的實驗組各時間點U251細胞增殖抑制率見表2。由表2可見，10、20、40、80 μmol /L 冬凌草甲素對U251細胞的增殖在不同的時間點上均有抑制作用；與20 μmol /L冬凌草甲素相比，40、80 μmol /L冬凌草甲素作用48、72 h時的細胞增殖抑制率明顯降低(P均lt;0.05)。隨著作用時間的延長，20、40、80 μmol /L冬凌草甲素對U251細胞的增殖抑制率依次降低(P均lt;0.05)。

表2 加入不同濃度冬凌草甲素的實驗組各時間點U251細胞增殖抑制率

2.3 冬凌草甲素對U251細胞NF-κB蛋白表達的影響 培養48 、72 h時實驗組和對照組U251細胞中的NF-κB蛋白相對表達量比較見表3。由表3可見，與對照組相比，不同濃度的冬凌草甲素作用U251細胞48 、72 h時，U251細胞中NF-κB蛋白的表達均下調；與對照組相比，40、80 μmol /L的冬凌草甲素作用48、 72 h時，U251細胞中NF-κB的相對表達量明顯降低(P均lt;0.05)。

表3 培養48 、72 h時實驗組和對照組U251細胞中的NF-κB蛋白相對表達量比較

注：與對照組相比，*Plt;0.05。

3 討論

腦膠質瘤是顱內最常見也是致死率最高的惡性腫瘤，發病率約為十萬分之五，患者5年生存率較低，僅為20%左右[1,7]。近年來的研究[7]證實，NF-κB信號通路在腦膠質瘤的生長、侵襲和轉移相關基因的調節過程中發揮關鍵性作用。有研究[1,8]發現，在活化的星型膠質瘤細胞中和高級別的膠質瘤細胞中NF-κB表達增強，而在低級別的星型膠質瘤細胞中NF-κB的表達明顯減弱，在正常腦組中NF-κB表達很弱甚至無法檢出。如果能夠有效抑制NF-κB通路就可以降低腫瘤的增殖速度，為臨床治療腦膠質瘤提供一條新的途徑。

天然抗腫瘤藥物是近年來中藥藥理研究的熱點之一。有研究[9～12]發現，冬凌草甲素能夠抑制不同組織來源的人源性腫瘤細胞的生長，其中包括肺癌細胞株A149、肝癌細胞株HepG-2、胃癌細胞株MKN45和膀胱癌細胞株MB49等，而且其不良反應低，對肝、腎、骨髓等多種器官均無明顯損傷。冬凌草甲素能夠通過多種途徑發揮對腫瘤生長的抑制作用，可以通過誘導腫瘤細胞凋亡、阻止腫瘤細胞從G1期進入S期、誘導腫瘤細胞發生自噬、調節細胞周期蛋白蛋D1的合成及抑制端粒酶活性等途徑來發揮抗腫瘤作用[13]。目前認為冬凌草甲素發揮抗腫瘤作用的機制與調節Wnt信號通路、Caspase調控的凋亡信號通路及活化ATR通路和NF-κB通路有關[14]。

本研究發現濃度為40 μmol /L和80 μmol /L的冬凌草甲素在離體情況下對U251細胞作用48 h可對其生長發揮明顯的抑制作用，并且這種抑制作用呈現一定的時間和劑量依賴性，作用72 h時對U251的抑制率可達50%以上。在經過濃度為40 μmol /L和80 μmol /L的冬凌草甲素孵育48 h后，U251細胞中NF-κB蛋白的相對表達量明顯降低，孵育72 h后U251細胞中NF-κB蛋白的相對表達量進一步降低。這一研究結果顯示，冬凌草甲素在體外可殺傷人腦膠質瘤細胞株U251，抑制其增殖，下調其NF-κB蛋白的表達。推測凌草甲素對U251細胞的殺傷、增殖抑制作用可能與其對NF-κB信號通路發揮調節作用有關，也進一步提示NF-κB蛋白對于調控腫瘤細胞的增殖發揮重要作用，如果能夠有效抑制NF-κB蛋白的表達就能抑制腦膠質瘤細胞的生長。

綜上所述，腦膠質瘤作為一種惡性的神經系統腫瘤一直是臨床治療的難點之一，冬凌草甲素有望作為NF-κB通路的抑制劑實現抑制腦膠質瘤生長的目的，由于其不良反應小，對肝、腎、骨髓等多種器官均無明顯損傷，具有潛在臨床應用價值。

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Effectsoforidoninonkilling,proliferation,andexpressionofNF-κBproteinofhumangliomaU251cellline

YUANHeyi1,WANGLimin,LIUJun,LINDayong,LIUHong,BAIJian,ZHANGLiyan

(1LaboratoryAnimalCenter,LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Liaoning110847,China)

ObjectiveTo observe effects of oridonin on killing, proliferation, and expression of NF-κB protein of human glioma U251 cell line.MethodsU251 cells were incubated with oridonin at the concentrations of 10, 20, 40, and 80 μmol/L respectively. At the same time, U251 cells incubated without oridonin were taken as the control group. U251 counting, IC50, U251 cell proliferation inhibition rate and expression of NF-κB were detected at different time points.ResultsCompared with the control group, the number of U251 cells in the 40 and 80 μmol/L oridonin groups decreased significantly (Plt;0.05). After incubation for 24, 48 and 72 h, the IC50of U251 cells was 82.2, 65.3 and 44.1 μmol/L, respectively. Compared with 20 μmol/L oridonin group, the cell proliferation inhibition rates of the 40 and 80 μmol/L oridonin groups were significantly reduced at 48 and 72 h (Plt;0.05). Compared with the control group, the expression of NF-κB in U251 cells decreased significantly (Plt;0.05) in the 40 and 80 μmol/L oridonin group at 48 and 72 h.ConclusionsOridonin can kill U251 cells, inhibit its proliferation and down-regulate NF-κB protein in vitro. The killing effect and inhibition can be related to the regulation of NF-κB signaling pathway.

oridonin; glioma; cell growth; cell proliferation; NF-κB signaling pathway; NF-κB protein

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.43.005

R329.2

A

1002-266X(2017)43-0014-03

遼寧省自然科學基金資助項目(201602506)。

苑鶴毅(1986-)，女，學士，助理實驗師，主要研究方向為抗腫瘤藥物的機制研究。E-mail： 15342437@qq.com

張麗艷(1975-)，女，博士，副教授，主要研究方向為腫瘤的中藥治療。E-mail： 512367830@qq.com

2017-08-01)