亞抑菌濃度環(huán)丙沙星對(duì)大腸埃希菌喹諾酮類耐藥質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的影響

鄂順梅，龍一飛，曾建明，魯洋，陳茶

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣州510006)

亞抑菌濃度環(huán)丙沙星對(duì)大腸埃希菌喹諾酮類耐藥質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的影響

鄂順梅，龍一飛，曾建明，魯洋，陳茶

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣州510006)

目的探討亞抑菌濃度環(huán)丙沙星對(duì)大腸埃希菌喹諾酮類耐藥質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的影響。方法采用PCR法篩選含有質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因[包括qnrA、qnrB、qnrC、aac(6′)-Ib-c基因]的大腸埃希菌作為供體菌；質(zhì)粒接合試驗(yàn)分析喹諾酮類耐藥質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移能力；不同亞抑菌濃度的環(huán)丙沙星處理供體菌后，觀察喹諾酮類耐藥質(zhì)粒接合效率的改變。結(jié)果16株供體菌攜帶質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因，其中6株供體菌攜帶的喹諾酮類耐藥質(zhì)粒可以接合轉(zhuǎn)移，接合效率為2.6×10-2～1.2×10-1；接合效率最高的1株供體菌經(jīng)不同亞抑菌濃度的環(huán)丙沙星處理后，其接合效率最高可較無(wú)環(huán)丙沙星處理組增加1.5倍。結(jié)論亞抑菌濃度的環(huán)丙沙星可以促進(jìn)大腸埃希菌喹諾酮類耐藥質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移。

細(xì)菌耐藥；質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥；耐藥質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移；大腸埃希菌; 環(huán)丙沙星; 抗生素亞抑菌濃度

大腸埃希菌(E.coli)是院內(nèi)感染和交叉感染的主要致病菌之一。抗生素的不合理應(yīng)用使E.coli的耐藥問(wèn)題日趨嚴(yán)重[1，2]。作為一種廣譜高效的抗生素，喹諾酮類抗生素廣泛用于治療E.coli引起的感染，然而近幾年E.coli對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥率逐年上升，局部地區(qū)耐藥率高達(dá)70%[3]。E.coli對(duì)喹諾酮類抗生素的耐藥機(jī)制復(fù)雜多樣，其中質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥(PMQR)[4]，因其可通過(guò)細(xì)菌間基因水平轉(zhuǎn)移(HGT)而使耐藥基因在細(xì)菌間水平傳播，導(dǎo)致院內(nèi)感染大范圍流行而備受關(guān)注。隨著抗生素使用的增加，細(xì)菌對(duì)其抗性也隨之增加，反之亦然。這種情況不僅限于E.coli等革蘭陰性桿菌，革蘭陽(yáng)性球菌亦是如此，如在減少紅霉素的使用以后，A類鏈球菌抗生素耐藥株的數(shù)量減少[5]。若抗生素是導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)的原因，那么可否將這一現(xiàn)象解釋為“抗生素對(duì)HGT有一定的促進(jìn)作用”呢？基于接合反應(yīng)對(duì)HGT具有重要的促進(jìn)作用[6,7]，我們推測(cè)抗生素能通過(guò)促進(jìn)細(xì)菌接合反應(yīng)而加速耐藥基因在細(xì)菌間的轉(zhuǎn)移[8]。通常抗生素對(duì)細(xì)菌的作用具有濃度和時(shí)間依賴性，為達(dá)到抑制甚至殺滅細(xì)菌的作用，臨床應(yīng)用抗生素時(shí)需根據(jù)藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)定時(shí)定量給藥，以維持抗生素的濃度大于其最小抑菌濃度(MIC)[10]。然而，實(shí)際上有多種因素導(dǎo)致到達(dá)感染部位的抗生素僅達(dá)到“亞抑菌濃度，即亞MIC”(sub-MIC)而殺滅不了細(xì)菌。sub-MIC的抗生素可導(dǎo)致細(xì)菌發(fā)生一系列的反應(yīng)，如促進(jìn)接合反應(yīng)[10]。為此，2016年6～12月，我們就不同sub-MIC的環(huán)丙沙星對(duì)E.coli的喹諾酮類耐藥質(zhì)粒接合效率的影響進(jìn)行了觀察。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院2015年1～12月分離的E.coli菌株，其中包括環(huán)丙沙星耐藥或中介菌株60株、環(huán)丙沙星敏感菌株15株，共75株，無(wú)重復(fù)菌株；75株E.coli菌株采用VITEK2全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)鑒定，-70 ℃保存。對(duì)疊氮化鈉耐藥的E.coli J53AZr菌株由上海復(fù)旦大學(xué)王明貴教授饋贈(zèng)。

1.2 主要試劑 革蘭陰性細(xì)菌鑒定卡、革蘭陰性細(xì)菌藥敏卡、VITEK2全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)為法國(guó)生物梅里埃公司產(chǎn)品；PCR試劑盒、DNA Marker DL 2000為大連寶生物公司產(chǎn)品；抗生素標(biāo)準(zhǔn)品氨芐西林和環(huán)丙沙星購(gòu)自廣東省藥品檢驗(yàn)所及中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.3 E.coli菌株P(guān)MQR基因和接合相關(guān)基因的檢測(cè) 采用PCR技術(shù)。將75株E.coli菌株在血平板上分離出單個(gè)菌落。采用煮沸法提取75株E.coli的DNA，按菌株分離的時(shí)間先后順序?qū)?5株細(xì)菌進(jìn)行編號(hào)(1～75號(hào))。目的基因引物序列見(jiàn)表1(其中qnrA、qnrB，qnrS引物來(lái)自文獻(xiàn)[11]，aac(6′)-Ib-cr、traI、traG引物采用Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì))。采用多重PCR對(duì)qnrA、qnrB、qnrS進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)[11]。所有PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，并與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)提供的基因序列進(jìn)行比對(duì)以確定其基因型。

1.4 環(huán)丙沙星的MIC值測(cè)定 采用微量肉湯法。參照CLSI M07-A9進(jìn)行環(huán)丙沙星的MIC值測(cè)定。用倍比稀釋法稀釋環(huán)丙沙星，設(shè)置陰性對(duì)照孔與無(wú)抗生素對(duì)照孔，將100 μL稀釋后的環(huán)丙沙星藥液加入96孔聚苯乙烯板中。將新鮮復(fù)蘇的2～3個(gè)含有PMQR基因的E.coli菌株的單個(gè)菌落接種于3 mL 的LB營(yíng)養(yǎng)肉湯中并培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期，調(diào)濁度至0.5麥?zhǔn)蠁挝?約含細(xì)菌1×108CFU/mL)。將0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木合♂?0倍，然后向已加入環(huán)丙沙星藥液的96孔聚苯乙烯板每孔中加入10 μL(5×104CFU/孔)稀釋后的菌液，35 ℃孵育18～20 h，判讀結(jié)果。

表1 目的基因引物序列(5′-3′)

1.5 PMQR質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn) 采用液體接合法。①能夠接合轉(zhuǎn)移的E.coli菌株的篩選：用含有PMQR基因的E.coli菌株(PMQR陽(yáng)性菌株)作為供體菌，E.coli J53Azr菌株作為受體菌進(jìn)行接合試驗(yàn)，篩選能夠接合轉(zhuǎn)移的PMQR陽(yáng)性菌株。具體過(guò)程如下：挑取PMQR陽(yáng)性菌株和E.coli J53Azr菌株的單個(gè)菌落接種于LB營(yíng)養(yǎng)肉湯，分別培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。取96孔板，每孔加入100 μL的LB營(yíng)養(yǎng)肉湯，取1×106CFU供體菌和等量的受體菌接種于100 μL的LB營(yíng)養(yǎng)肉湯中接合2 h。取30 μL上述接合后菌液，1∶50稀釋后取30 μL涂布于含有50 μg/mL氨芐西林和50 μg/mL疊氮化鈉的LB瓊脂平板上，35℃培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)接合子數(shù)目并計(jì)算接合效率:接合效率=接合子菌落數(shù)/供體菌菌落數(shù)[12]。②sub-MIC的環(huán)丙沙星對(duì)接合反應(yīng)的影響：采用倍比稀釋法配制不同sub-MIC的環(huán)丙沙星溶液(環(huán)丙沙星濃度分別為1/16、1/32、1/64、1/128、1/256的MIC，同時(shí)設(shè)不加環(huán)丙沙星的對(duì)照組)，按照一定量加入3 mL的LB營(yíng)養(yǎng)肉湯中，將3×106CFU的接合效率最高的PMQR陽(yáng)性菌株接種于上述培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期，吸取1 mL菌液，4 000 r/min離心5 min，棄上清，加入1 mL的 LB營(yíng)養(yǎng)肉湯。然后按照上述方法與E.coli J53Azr菌株進(jìn)行接合試驗(yàn)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料比較用配對(duì)t檢驗(yàn)。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 E.coli菌株P(guān)MQR基因的檢測(cè)結(jié)果 從75株E.coli中分離到16株含有PMQR基因aac(6′)-Ib-cr、qnrB、qnrS的菌株(判為PMQR陽(yáng)性菌株)，沒(méi)有分離到含有qnrA基因的菌株。16株P(guān)MQR陽(yáng)性菌株均對(duì)氨芐西林耐藥，除43號(hào)菌株對(duì)環(huán)丙沙星敏感外，其余15株均對(duì)環(huán)丙沙星耐藥。16株P(guān)MQR陽(yáng)性菌株的耐藥基因分布情況及氨芐西林和環(huán)丙沙星的MIC見(jiàn)表2。

表2 PMQR陽(yáng)性菌株的耐藥基因分布及氨芐西林和環(huán)丙沙星的MIC(μg/mL)

注：環(huán)丙沙星的MIC值≤1 μg/mL為敏感、≥4 μg/mL為耐藥；氨芐西林的MIC值≤8 μg/mL為敏感、≥32 μg/mL為耐藥。

2.2 PMQR陽(yáng)性菌株與受體菌的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)結(jié)果 16株P(guān)MQR陽(yáng)性菌株中，只有11、22、28、43、58號(hào)PMQR陽(yáng)性菌株的質(zhì)粒能夠接合轉(zhuǎn)移，與受體菌E.coli J53Azr的接合效率分別為2.6×10-2、3.2×10-2、9.2×10-2、8.1×10-2、1.2×10-1。58號(hào)菌株接合效率最高，在接合18 h后就可見(jiàn)接合子長(zhǎng)出，其他菌株需要36 h才見(jiàn)接合子，所有單獨(dú)供體菌或受體菌在含有氨芐西林和疊氮化鈉的篩選板上培養(yǎng)48 h未見(jiàn)菌落生長(zhǎng)。在11、22、28、43、58號(hào)菌株中可以檢測(cè)到接合基因traI和traG(見(jiàn)圖1)，而在其他PMQR陽(yáng)性菌株中未檢測(cè)到上述兩種接合基因。

2.3 sub-MIC的環(huán)丙沙星對(duì)58號(hào)菌株中的喹諾酮類耐藥質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的影響 喹諾酮類耐藥質(zhì)粒接合效率最高的58號(hào)E.coli菌株，分別經(jīng)1/16、1/32、1/64、1/128、1/256 MIC的環(huán)丙沙星處理后，其與受體菌E.coli J53Azr的接合效率分別為0.12±0.02、0.15±0.04、0.18±0.05、0.21±0.06、0.27±0.07，未加環(huán)丙沙星的58號(hào)E.coli菌株與受體菌E.coli J53Azr的接合效率為0.10±0.02。與未加環(huán)丙沙星的菌株的接合效率相比，加入不同sub-MIC的環(huán)丙沙星菌株的接合效率均升高，其中加入1/256 MIC的環(huán)丙沙星菌株的接合效率升高1.5倍(Plt;0.05)。

注：A為traG接合基因在PMQR陽(yáng)性菌株中的表達(dá)；B為traI接合基因在PMQR陽(yáng)性菌株中的表達(dá)。

圖1接合基因traI和traG在PMQR陽(yáng)性菌株中的檢測(cè)結(jié)果

3 討論

質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥是新發(fā)現(xiàn)的一類喹諾酮類抗生素耐藥機(jī)制，該類質(zhì)粒具有廣泛的宿主，它可以通過(guò)接合的方式轉(zhuǎn)移到E.coli、肺炎克雷伯菌、傷寒沙門(mén)菌、銅綠假單胞菌等細(xì)菌中，即通過(guò)HGT使耐藥基因在細(xì)菌間水平傳播。在E.coli中PMQR基因主要有qnr基因(包括qnrA、qnrB、qnrS等)、氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶的變異基因aac(6′)-Ib-cr和喹諾酮外排蛋白基因(QepA或OqxAB)。Qnr等PMQR基因的單獨(dú)存在可以使菌株對(duì)喹諾酮藥物的敏感性降低，但可能并未達(dá)到具有臨床意義的喹諾酮耐藥水平或僅僅導(dǎo)致低水平的喹諾酮耐藥，不過(guò)含qnr等PMQR基因的菌株在長(zhǎng)期大量使用喹諾酮藥物時(shí)更容易發(fā)生染色體突變，或者含染色體突變的菌株在適宜的條件下可以捕獲qnr基因，在這兩種情況下菌株同時(shí)具有了質(zhì)粒和染色體介導(dǎo)的喹諾酮耐藥機(jī)制，引起高水平喹諾酮耐藥[13]。因此，質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥成為導(dǎo)致喹諾酮高水平耐藥的重要途徑[14]。

本研究在75株E.coli菌株中發(fā)現(xiàn)16株(21.3%)可檢出PMQR基因(qnrB，qnrC，aac(6′)-Ib-c)，其中12株檢出aac(6′)-Ib-cr、8株檢出qnrS、5株檢出qnrB，未檢出qnrA。Aac(6′)-Ib序列trp102arg和asp179tyr這兩個(gè)氨基酸突變后就成為喹諾酮耐藥基因aac(6′)-Ib-cr，經(jīng)測(cè)序證實(shí)所擴(kuò)增的片段均為aac(6′)-Ib-cr。本研究目的就是篩選含有PMQR基因的菌株作為后續(xù)接合實(shí)驗(yàn)的供體菌，因此盡可能選擇喹諾酮耐藥菌株為研究對(duì)象。

Qnr基因主要存在于Ⅰ類整合子中，并與其他多種耐藥基因如β內(nèi)酰胺酶共存于同一質(zhì)粒而導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)多種抗生素耐藥。含有aac(6′)-Ib-cr的菌株通常也與β內(nèi)酰胺酶基因共存。本研究篩選的16株P(guān)MQR陽(yáng)性E.coli菌株均對(duì)氨芐西林耐藥，而受體菌E.coli J53Azr對(duì)疊氮化鈉耐藥、對(duì)氨芐西林敏感，因此實(shí)驗(yàn)選用氨芐西林和疊氮化鈉篩選接合子。16株P(guān)MQR陽(yáng)性株中只有11、22、28、43、58號(hào)菌株的質(zhì)粒可以接合轉(zhuǎn)移，同時(shí)在這些能夠接合轉(zhuǎn)移的分離株中可以檢測(cè)到traI和traG接合基因。traI編碼松弛酶，啟動(dòng)接合反應(yīng)；traG編碼先導(dǎo)蛋白，使切開(kāi)的單鏈向受體菌轉(zhuǎn)移。其他不能接合的PMQR陽(yáng)性菌株中未檢測(cè)到上述兩種基因。這一結(jié)果提示接合反應(yīng)的發(fā)生與接合基因的表達(dá)密不可分。

sub-MIC的抗生素不能抑制細(xì)菌增殖，卻可以改變細(xì)菌的物理化學(xué)性質(zhì)[15]。低濃度的抗生素(環(huán)丙沙星，紅霉素，β-內(nèi)酰胺類)可以增加E.coli、金黃色葡萄球菌不同衍生物或大腸桿菌與金黃色葡萄球菌之間的耐藥性質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移頻率[16]。而許多其他抗生素，包括萬(wàn)古霉素和替考拉寧則沒(méi)有這樣的效果。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)接合效率最高的58號(hào)菌株經(jīng)不同sub-MIC的環(huán)丙沙星處理，再與E.coli J53Azr接合，其接合效率明顯升高，sub-MIC越小，接合效率越高，到1/256 MIC時(shí)接合效率增高約1.5倍。因此，我們認(rèn)為sub-MIC濃度的環(huán)丙沙星可以促進(jìn)喹諾酮耐藥質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移，但具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究確認(rèn)。

抗生素的不充分使用通過(guò)促進(jìn)多種耐藥基因的轉(zhuǎn)移而有助于增加細(xì)菌耐藥性，希望可以找到有效的預(yù)防措施來(lái)抵抗耐藥基因的接合轉(zhuǎn)移。喹諾酮通常以濃度依賴性方式殺死病原體，對(duì)于該類藥物的使用，維持藥物濃度高于MIC的時(shí)間長(zhǎng)度對(duì)于根除細(xì)菌是至關(guān)重要的。

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Effectofsub-minimuminhibitoryconcentrationofciprofloxacinonconjugativetransferofquinolone-resistantplasmidofEscherichiacoli

EShunmei,LONGYifei,ZENGJianming,LUYang,CHENCha

(TheSecondAffiliatedHospitalofGuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510006,China)

ObjectiveTo investigate the effect of sub-minimum inhibitory concentration of ciprofloxacin on the conjugative transfer of quinolone-resistant plasmid of Escherichia coli.MethodsQnrA, qnrB, qnrC, aac(6′)-Ib-c genes were confirmed by PCR and DNA sequencing. The transferability of the plasmids harboring PMQR genes was investigated by conjugation test, so as to screen transferable Escherichia coli as donor. The effect of ciprofloxacin on conjugative transfer of drug resistant plasmids was observed after treatment with Escherichia coli with sub-MIC of ciprofloxacin.ResultsThere were 16 strains of Escherichia coli which were detected the target genes. Among 16 strains of positive bacteria, the PMQR gene of the 6 strains was able to conjugative transfer, and the conjugative efficiency was between 2.6×10-2and 1.2×10-1. The conjugative efficiency of the 1 strain with the highest transfer efficiency could be up to 1.5 times when treated with different concentrations of ciprofloxacin.ConclusionThe sub-minimum inhibitory concentration of ciprofloxacin can promote the conjugative transfer of quinolone-resistant plasmids.

antibiotic resistance of bacteria; plasmid-mediated quinolone resistance； conjugation transfer of resistant plasmid; Escherichia coli; ciprofloxacin; antibiotic sub-minimum inhibitory concentration

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.43.008

R378

A

1002-266X(2017)43-0025-04

廣東省公益研究與能力建設(shè)專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(2014A020212281)；廣州中醫(yī)藥大學(xué)拔尖人才科研專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(2014KT1491)。

鄂順梅(1978- )，女，碩士，副主任技師，主要研究方向?yàn)榧?xì)菌耐藥機(jī)制。E-mail: sanhesi@163.com

陳茶(1970- )，男，碩士，教授，主要研究方向?yàn)榧?xì)菌耐藥機(jī)制。E-mail: chencha906@163.com

2017-07-26)