基質(zhì)輔助激光解析電離

楊輝

【摘 要】目的探究基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜儀在臨床微生物鑒定中的應(yīng)用，為真菌微生物的鑒定提供臨床技術(shù)支持。方法選取于2015年3月到2017年2月我院臨床采集的真菌作為實驗標(biāo)本，利用基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜儀對菌種進(jìn)行鑒定，分析基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜儀對菌種鑒定的檢查效果。結(jié)果300株真菌中有290株（96.67%）經(jīng)鑒定后可以正確歸類到種水平，6株（2%）未能給出鑒定成果，4株（1.33%）鑒定結(jié)果出現(xiàn)錯誤，且正確率與傳統(tǒng)方法相比差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜儀穩(wěn)定性高，可重復(fù)性好，并且具有快速準(zhǔn)確的優(yōu)點，是臨床鑒定微生物種類的一種快速可靠的高通量方法，可以為臨床的微生物鑒定提供一定的技術(shù)支持。

【關(guān)鍵詞】基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜儀；微生物鑒定；臨床應(yīng)用

真菌感染是指由于機(jī)體感染真菌而引起的一系列疾病，感染類型大致包括表面感染，皮膚感染，皮下組織感染，深部感染以及條件性感染[1-4]。發(fā)生真菌感染的原因有很多，主要包括以下五個方面：（1）濫用抗生素：隨著光譜抗生素的廣泛應(yīng)用，越來越多的人們選擇利用抗生素來治療細(xì)菌感染，這些抗生素在治療感染的同時也會減少有益菌的數(shù)量，從而破壞機(jī)體菌種平衡。（2）糖皮質(zhì)激素的過量使用：針對炎癥患者以及皮膚病患者糖皮質(zhì)激素的使用是必不可少的，然而這些藥物的使用卻會導(dǎo)致人體的免疫系統(tǒng)功能下降，為真菌感染創(chuàng)造了有利條件。（3）遺傳因素：遺傳因素也是機(jī)體產(chǎn)生真菌感染的一個重要原因，相對于正常人，這類人群由于遺傳物質(zhì)的差異性導(dǎo)致他們更容易受到真菌的侵襲。（4）免疫系統(tǒng)功能障礙：由于化療或者免疫系統(tǒng)缺陷癥等因素導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)功能發(fā)生障礙，從而給真菌染感染創(chuàng)造了一個適宜生長的環(huán)境[5-9]。因此真菌感染在臨床上也越來越多見。常見的實驗室真菌鑒定方法是常規(guī)傳統(tǒng)真菌鑒定方法，這種方法操作復(fù)雜，鑒定周期較長，對于設(shè)備以及技術(shù)水平的要求較高，因此往往會造成臨床診斷以及治療的滯后性，會廣大醫(yī)患人員帶來較大的困擾，然而隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)出現(xiàn)在人們視野之中。基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)是一種快速鑒定微生物種類的新技術(shù)，近年來廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物等多個領(lǐng)域[10]。因此本次研究通過比較傳統(tǒng)真菌鑒定方法與基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)對菌種鑒定的準(zhǔn)確率，探究基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜儀在臨床微生物鑒定上的應(yīng)用。

1 資料與方法

1.1 菌種來源

本次研究一共選取300株真菌作為研究對象，全部菌株均來自于2015年3月到2017年2月我院臨床采集的真菌，質(zhì)控菌種為白念珠菌ATCC14053和大腸埃希菌ATCC25922。

1.2 試驗儀器與設(shè)備

法國梅里埃公司的基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜儀以及配套的數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)，電子顯微鏡，水浴鍋，無菌注射器，基質(zhì)液，一次性無菌試管，全自動微生物鑒定儀，真菌培養(yǎng)箱，離心機(jī)，移液槍等。

1.3 實驗方法

對采集來的真菌標(biāo)本進(jìn)行分離培養(yǎng)，標(biāo)本接種在平板上在36℃的真菌培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，直到肉眼可見菌落時進(jìn)行細(xì)菌種類鑒定。對所有菌種同時采用兩種方法進(jìn)行鑒定，分別為常規(guī)傳統(tǒng)真菌鑒定方法以及基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)，對比兩種結(jié)果準(zhǔn)確率。常規(guī)真菌鑒定方法是將菌落進(jìn)行革蘭氏染色，同時對菌落進(jìn)行鏡檢，通過對菌落的形態(tài)以及革蘭氏染色結(jié)果進(jìn)行分析。基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜法是將真菌接種到靶板上，然后再菌膜沒有完全干燥之前加入α-腈基-4-羥基肉桂酸基質(zhì)，等待基質(zhì)和菌株混合物完全干燥后將樣本放入儀器中進(jìn)行分析掃描，利用數(shù)據(jù)庫進(jìn)行鑒定，判斷菌株種類。結(jié)果結(jié)果可信程度在60.0%-99.9%之間且結(jié)果為一個是認(rèn)為該結(jié)果可以接受。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料采用百分比表示，進(jìn)行卡方檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 真菌鑒定種類分布

經(jīng)過鑒定，300株真菌種類分別為：熱帶念珠菌、白色念珠菌、阿薩斯酵母菌、煙曲霉米曲霉、宛氏擬青霉、煙草赤星病菌，詳細(xì)數(shù)據(jù)見下表。

2.2 兩種方法鑒定真菌的正確率比較

本次研究采用了兩種真菌鑒定方法，常規(guī)鑒定組共檢查300株真菌，其中正確的有156株，正確率為52.00%，100例檢查錯誤，44例未檢出；基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)共檢查300株真菌，其中290株檢查正確，正確率為96.67%， 6株（2%）未能給出鑒定成果，4株（1.33%）鑒定結(jié)果出現(xiàn)錯誤。兩組檢查方法正確率存在差異，基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)檢查正確率遠(yuǎn)高于常規(guī)鑒定組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。詳細(xì)數(shù)據(jù)見表2

3 討論

基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)是近年來出現(xiàn)的一種軟電離新型有機(jī)質(zhì)譜，這種新的技術(shù)手段已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)行業(yè)，是檢測和鑒定多肽大分子物質(zhì)以及蛋白質(zhì)的有效手段，具有十分高的靈敏度，并且檢測的準(zhǔn)確率高，操作簡單，檢測周期短，穩(wěn)定性高，是十分方便快捷的技術(shù)[11-13]。基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)可應(yīng)用于多個領(lǐng)域，其中基于細(xì)菌表面蛋白分子量進(jìn)行細(xì)菌鑒定的技術(shù)尤為引人注意。通過將微生物和等量的基質(zhì)分別點加在加樣板上形成混合物，然后利用激光的能量使樣品解離，通過計算不同物質(zhì)飛行時間不同來檢測離子分子量，然后應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)對結(jié)果進(jìn)行處理，生成特異性的蛋白質(zhì)組指紋圖，從而進(jìn)行對比分析，鑒定微生物種類[14-16]。由于這種檢測方法是利用蛋白質(zhì)圖譜來進(jìn)行的，而每種微生物的蛋白組成受遺傳因素的影響，不受外界環(huán)境等因素的制約，因此相對于其他的檢測手法，這種蛋白質(zhì)圖譜法能更為直觀準(zhǔn)確的進(jìn)行微生物的鑒定。endprint

在本次研究中，我們發(fā)現(xiàn)新的基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)檢查的正確率為96.67%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的檢查手法，說明基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)具有準(zhǔn)確率高的特點，并且在進(jìn)行實際的操作實驗中，傳統(tǒng)的實驗方法是基于形態(tài)學(xué)或生理生化特性進(jìn)行鑒定，需要的時間較長，且操作繁瑣，而且對于一些相似的菌種鑒別過程仍然存在一定的困難；但是利用這種新型技術(shù)操作的時間就大大減少，首先進(jìn)行2-3天的菌株培養(yǎng)，等待菌株生長完成后進(jìn)行樣本的制備，該過程僅需花費不到半個小時，因此時間大大的減少。曾有研究表明[17]，基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)常見的人畜病原菌檢測中具有較好的準(zhǔn)確率，對于單增李斯特菌、沙門氏菌、肺炎鏈球菌等病原菌都有十分高的準(zhǔn)確率。Phillips等曾經(jīng)對對來自病人的437個菌株進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜測試，差異結(jié)果用16S 基因進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法鑒定菌株的正確率高達(dá)95.1%[18]。同時對980 株來自臨床的細(xì)菌和酵母菌株進(jìn)行確認(rèn)，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)鑒定種的正確率（95.34%）明顯高于傳統(tǒng)的生化鑒定系統(tǒng)（83.1%）。并且，這種新型技術(shù)可以直接檢測來自醫(yī)院臨床病人的樣本，不需要經(jīng)過純培養(yǎng)，因此檢測時間短，對于患者的臨床診斷以及治療有很大的幫助作用，在急性病原菌感染患者的檢測和治療上均有十分廣闊的應(yīng)用前景[19，20]。

綜上所述，基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)在微生物鑒定上具有高正確率、高敏感性以及高穩(wěn)定性，并且操作簡單，鑒定周期短，價格低廉，適合在臨床上進(jìn)行推廣應(yīng)用。

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