韓國產芝麻醬油對AAPH誘發LLC-PK1細胞氧化應激的保護作用

趙 欣，易若琨，馮 霞，宋家樂*

（1.重慶第二師范學院生物與化學工程學院，重慶市功能性食品協同創新中心，重慶市功能性食品工程技術研究中心，功能性食品研發重慶市工程實驗室，重慶 400067；2.桂林醫學院公共衛生學院，食品衛生與營養學教研室，廣西 桂林 541004；3.韓國釜山大學食品科學與營養學系，韓國 釜山 609-735）

韓國產芝麻醬油對AAPH誘發LLC-PK1細胞氧化應激的保護作用

趙 欣1，易若琨1，馮 霞1，宋家樂2,3,*

（1.重慶第二師范學院生物與化學工程學院，重慶市功能性食品協同創新中心，重慶市功能性食品工程技術研究中心，功能性食品研發重慶市工程實驗室，重慶 400067；2.桂林醫學院公共衛生學院，食品衛生與營養學教研室，廣西 桂林 541004；3.韓國釜山大學食品科學與營養學系，韓國 釜山 609-735）

以芝麻釀造醬油乙醇提取物（ethanol extract sesame sauce，SSE）為研究對象，探討其對1 mmol/L 2,2’-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（2,2’-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride，AAPH）引發的LLC-PK1豬腎近曲小管上皮細胞氧化應激損傷的保護作用。方法：LLC-PK1細胞與不同質量濃度（10～100 μg/mL）的SSE預先共同培養24 h后，用含AAPH的DMEM培養液繼續培養4 h建立細胞損傷模型。細胞存活率用四甲基偶氮唑藍法檢測，細胞內丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和總活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）水平分別以硫代巴比妥酸比色法和2’,7’-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉探針法測定。細胞內過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、谷胱甘肽巰基轉移酶（glutathione S-transferase，GST）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamylcysteine synthetase，γ-GCS）活力和谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量按試劑盒說明書以比色法測定。結果表明，SSE預處理可以提高受損細胞存活率，降低細胞內總ROS水平和MDA含量。同時，SSE還能提高受損細胞內抗氧化酶（CAT、SOD、GSH-Px）及γ-GCS活力并提高細胞內GSH含量。實時熒光定量聚合酶鏈式反應分析也提示SSE能上調細胞內抗氧化物酶（CAT、SOD和GSH-Px）的mRNA表達量。此外，SSE可以通過提高細胞內源性抗氧化系統能力來降低細胞內MDA和ROS水平，并由此緩解AAPH對LLC-PK1細胞所造成的氧化應激損傷。

芝麻醬油；氧化損傷；抗氧化；LLC-PK1細胞

醬油是一種富含氨基酸、維生素、煙酸、鈣和磷等多種營養成分的傳統液體發酵食品[1]。通常醬油主要是以大豆等為原料，再輔以水、豆粕、淀粉、小麥、麩皮和食鹽等經制曲、發酵、過濾、滅菌等過程釀制而成。研究發現，醬油具有抗氧化、抗癌、抗炎癥、抗突變、降血壓等功效[2-9]。相對于傳統的黃豆醬油而言，芝麻釀造醬油則是一款以脫脂芝麻替代傳統大豆進行醬油發酵的新型醬油調味品。其發酵工藝與傳統的大豆醬油類似，目前在韓國市場上較受歡迎。

LLC-PK1細胞是一種常用于研究氧化應激損傷導致腎臟上皮細胞損傷的豬源細胞系[17]。為研究芝麻釀造醬油在對抗氧化應激損傷所致疾病方面潛在的預防保健功效，本研究以2,2’-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（2,2’-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride，AAPH）處理豬腎近曲小管上皮LLC-PK1細胞構建細胞氧化損傷模型，探究芝麻釀造醬油對AAPH所致細胞氧化應激損傷的保護作用機制，為芝麻釀造醬油預防氧化應激引起的腎臟疾病提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株、材料與試劑

豬腎近曲上皮小管細胞系LLC-PK1由韓國釜山大學營養學系Kunyoung Park教授饋贈。

實驗用芝麻釀造醬油為韓國Daesang食品株式會社制造，并由該公司中央研究所提供。取冷凍干燥后的醬油樣品（約100 mg），按樣品與提取試劑比例為1∶10（m/V）加入80%乙醇溶液，室溫攪拌過夜提取后抽濾，該過程重復3 次后合并濾液。所得濾液經3 000×g離心15 min后棄渣收集上清液，經50 ℃真空減壓旋轉蒸發后，制備得到芝麻醬油乙醇提取物（ethanol extract from sesame sauce，SSE）并用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）配成質量濃度為20 mg/mL的儲備液，-80 ℃貯存待用。

AAPH、四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、2’,7’-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉（dichloro-dihydro-fluorescein diacetate，DCFH-DA）、青霉素-鏈霉素雙抗 美國Sigma公司；DMEM細胞培養液、胎牛血清、Trizol試劑、Oligo(dT)18、RNase、dNTP、MLV逆轉錄酶 美國Invitrogen公司；ROX reference dye、SYBR Premix Ex TaqⅡ 日本Takara公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、谷胱甘肽巰基轉移酶（glutathione S-transferase，GST）試劑盒、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamylcysteine synthetase，γ-GCS）試劑盒、谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒南京建成生物工程研究所；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

EYELA N-1001S旋轉蒸發儀 日本東京理化器械株式會社；MCO-15AC二氧化碳細胞培養箱 日本三洋公司；Centrifuge 5418R冷凍離心機 德國Eppendorf公司；ELx808酶標儀 美國Bio-Tek公司；QuantStudioTM6 Flex聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀美國Thermo Fisher Scientif i c公司；FLUOstar OPTIMA熒光酶標儀 德國BMG公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養及分組

LLC-PK1細胞以DMEM細胞培養液（含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素雙抗溶液）放置于37 ℃、5% CO2環境中濕化培養，每2 d換液一次。實驗時細胞按1×104、2×105個/孔分別接種于96 孔和6 孔細胞培養板中。以DMEM培養液（含1 mmol/L AAPH）繼續培養4 h制備氧化損傷細胞模型。氧化損傷模型細胞分別按1×104個/孔，每孔100 μL接種于96 孔板后，依前期研究，以不同質量濃度的SSE（10、50、100 μg/mL）繼續培養24 h并進行后續實驗[9]。未經過AAPH誘導處理的正常LLC-PK1細胞作為正常組。

1.3.2 MTT法測定細胞存活率

LLC-PK1細胞首先按前述分組處理并進行24 h連續培養后，棄去孔內培養基并加入終質量濃度為0.5 mg/mL的MTT溶液（100 μL）繼續培養4 h。培養結束后棄上清液，每孔加入100 μL DMSO避光振蕩30 min，測定OD490nm后按公式（1）計算細胞存活率。

1.3.3 細胞內MDA含量的測定

細胞按照1.3.1節處理后，采用硫代巴比妥酸比色法測定細胞內MDA含量[18]。所有細胞經冷磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗后，用細胞刮刀進行收集并加入預冷的細胞裂解液裂解細胞。隨后在5 mL的玻璃試管中依次加入500 μL細胞裂解上清液、質量分數為15%的三氯乙酸與0.67%硫代巴比妥酸混合溶液400 μL，充分混勻并在95 ℃水浴中保溫20 min。冷卻后，加入3 mL異丙醇提取色素并測定OD532nm，細胞總蛋白質量以蛋白質試劑盒定量。按照公式（2）計算MDA含量。

1.3.4 細胞內ROS含量的測定

在6 孔細胞培養板中按照1.3.1節方法處理細胞后，加入含20 μmol/L的DCFH-DA試劑的DMEM培養液37 ℃條件下孵育20 min，冷PBS清洗處理過的細胞2 次，在激發波長為485 nm，發射波長為530 nm的條件下用FLUOstar OPTIMA熒光酶標儀測定熒光強度，按照公式（3）計算ROS相對含量。

1.3.5 細胞內抗氧化酶活力、GSH含量和γ-GCS活力的測定

細胞按2×105個/孔接種于6 孔板，之后按1.3.1節方法進行處理。待處理結束后，取適量細胞裂解液，按SOD、CAT、GSH-Px、GSH和γ-GCS各自的測定試劑盒說明書步驟操作，酶活力以酶比活力（U/mg pro）表示，GSH含量和γ-GCS活力以μmol/mg pro表示，并用細胞總蛋白質含量作校正。

1.3.6 實時熒光定量PCR法檢測SSE對LLC-PK1細胞相關抗氧化基因表達的影響

依照Trizol試劑說明書提取待測細胞內總RNA，經紫外法檢測純度后，調整各樣品組的總RNA濃度至同一水平。取每組等量mRNA（2 μg）分別依次加入到含有Oligo（dT）18、RNase、dNTP和MLV酶各1 μL，5×buffer 10 μL的滅菌PCR試管中。在37 ℃ 120 min，99 ℃ 4 min，4 ℃ 3 min條件下合成cDNA。隨后用實時熒光定量PCR法檢測抗氧化物酶CAT、GSH-Px和SOD的mRNA表達量。在總反應體系中（20 μL）加入cDNA（2 μL）、上游和下游引物（10 μmol/L）各1 μL、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（2×） 10 μL、ROX reference dye（50×） 0.4 μL和滅菌雙蒸水5.6 μL，充分混勻上述試劑后置于QuantStudioTM6 Flex PCR儀中進行反應。擴增反應條件為95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共35 個循環；72 ℃ 5 min。每個基因cDNA樣本平行擴增3 次，并取Ct值的均值，按照公式（4）對目的基因的表達量（F）進行計算。持家基因GAPDH作為內參。

式中：Ct1～4分別為檢測樣本中基因、檢測樣本中GAPDH、空白樣本中基因、空白樣本中GAPDH的Ct值。

1.4 數據統計分析

所有實驗均重復3 次，結果以 ±s表示，利用SPSS 19.0統計軟件分析，采用單因素方差分析進行數據統計分析，p＜0.05為具有統計差異。

2 結果與分析

2.1 SSE對受損LLC-PK1細胞存活率的影響

圖1 SSE對受損LLC-PK1細胞存活率的影響（A）和對AAPH處理后細胞的保護效果（B）Fig. 1 Effect of SSE on cell viability in LLC-PK1 cells (A), and protective effects of SSE on AAPH treated LLC-PK1 cells (B)

如圖1A所示，經質量濃度分別為10、50、100 μg/mL的SSE處理后，LLC-PK1細胞的存活率均超過90%。該結果提示SSE對LLC-PK1細胞無明顯的細胞毒性作用。因此在后續的研究中，10、50、100 μg/mL為對細胞生存無影響的安全濃度。此外，相比正常組細胞而言，直接暴露于AAPH（1 mmol/L）4 h后可造成LLC-PK1細胞生存率顯著下降（p＜0.05）。而經不同質量濃度SSE處理24 h后，受損細胞的存活率較未處理細胞有所上升，且保護效果隨SSE的質量濃度增加而增強，特別是在較高質量濃度處理時（50、100 μg/mL）保護效果顯著（p＜0.05）。

2.2 SSE對受損LLC-PK1細胞內MDA含量和ROS相對含量的影響

圖2 SSE對受損LLC-PK1細胞內MDA含量（A）和ROS相對含量（B）的影響Fig. 2 Effect of SSE on the levels of MDA (A) and ROS (B) in LLC-PK1 cells exposed to AAPH

由圖2可知，經1 mmol/L AAPH處理4 h后，LLC-PK1細胞內MDA的含量較正常細胞內MDA含量顯著上升（p＜0.05）。但在給予不同質量濃度SSE（10、50、100 μg/mL）后，細胞內MDA含量發生顯著下降（p＜0.05），在經100 μg/mL的SSE處理時，細胞內MDA含量最低。同時，AAPH處理還能造成LLC-PK1細胞內ROS水平顯著升高（p＜0.05）。而經過不同質量濃度SSE（10、50、100 μg/mL）處理24 h后，受損細胞內的ROS水平呈逐漸降低趨勢。且SSE在100 μg/mL時，具有較強的ROS抑制能力。

2.3 SSE對受損LLC-PK1細胞內CAT、SOD和GSH-Px活力的影響

表1 SSE對受損LLC-PK1細胞CAT、SOD和GSH-Px活力的影響Table 1 Effect of SSE on the levels of CAT, SOD and GSH-Px activity in LLC-PK1 cells exposed to AAPH

如表1所示，AAPH造成LLC-PK1細胞內CAT、SOD和GSH-Px活力的降低。相反，經不同質量濃度SSE（10、50、100 μg/mL）處理24 h后，受損細胞內的抗氧化酶活力逐漸升高，與未經SSE處理的損傷模型組相比存在顯著差異（p＜0.05）。

2.4 SSE對受損LLC-PK1細胞內γ-GCS活力和GSH含量的影響

由圖3可知，AAPH處理不僅能夠明顯抑制細胞內γ-GCS活力，同時還能造成細胞內GSH含量顯著降低（p＜0.05）。而經SSE（10、50、100 μg/mL）處理24 h后，受損的LLC-PK1細胞內γ-GCS活力逐漸增高。同時，細胞內GSH含量也得以恢復并呈增高趨勢。且與損傷模型組相比，較高劑量的SSE（50、100 μg/mL）對受損的LLC-PK1細胞中γ-GCS活力和GSH含量的干預作用明顯（p＜0.05）。

圖3 SSE對AAPH致損LLC-PK1細胞內GSH含量（A）和γ-GCS活力（B）的影響Fig. 3 Effect of SSE on the levels of GSH (A) and γ-GCS (B) in LLCPK1 cells exposed to AAPH

2.5 SSE對受損LLC-PK1細胞內SOD、GSH-Px和CAT基因表達水平的影響

圖 4 SSE對受損LLC-PK1細胞內SOD（A）、GSH-Px（B）和CAT（C）基因表達的影響Fig. 4 Effect of SSE on the gene expression of SOD (A) , GSH-Px (B)and CAT (C) in LLC-PK1 cells exposed to AAPH

由圖4可知，通過實時熒光定量P C R分析發現，1 mmol/L的AAPH造成LLC-PK1細胞內SOD、GSH-Px和CAT這3 種主要內源性抗氧化物酶mRNA表達水平顯著降低（p＜0.05）。而由SSE處理后，受損LLC-PK1細胞中的內源性抗氧化酶SOD、GSH-Px和CAT基因的表達水平逐步增強。與損傷模型組相比，較高劑量（50、100 μg/mL）SSE對受損的LLC-PK1細胞中SOD、GSH-Px和CAT基因的表達水平干預作用明顯（p＜0.05）。

3 討 論

ROS在機體內的過度蓄積常被認為是各類慢性疾病的重要致病要素之一。作為一種重要的自由基供體，偶氮類化合物AAPH可自發生成過氧自由基。而過氧自由基能造成細胞內DNA、蛋白質和脂類等生物大分子的損傷，導致細胞死亡。本研究發現，LLC-PK1細胞暴露于AAPH（1 mmol/L）后，細胞存活率明顯下降。給予不同質量濃度的SSE處理24 h后，LLC-PK1細胞存活率較未經SSE處理的受損細胞明顯增高（p＜0.05）。同時，機體內部過量生成或者是蓄積的ROS還可導致細胞膜上的不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應，導致對細胞具有毒性作用的脂質過氧化產物MDA和4-羥基壬烯醛的大量生成[19-20]。因此，MDA常被作為一種衡量氧化應激對細胞造成損傷的標志物[21]。在受損的LLC-PK1細胞中，SSE處理可以降低受損細胞內總ROS水平并降低MDA含量。這可能是由于芝麻醬油中含有較為豐富的芝麻素（13 μg/g）和表芝麻素（13.7 μg/g）等具有強抗氧化能力的木脂素類化合物[22]。目前，也有相關的文獻指出，給予適當的抗氧化劑可以降低由ROS引發的腎臟細胞的脂質過氧化程度，同時也有助于防止腎臟細胞發生氧化應激性損傷[23]。在臨床研究中也提示，通過攝入富含抗氧化成分的膳食可以降低慢性腎臟疾病患者體內的氧化應激水平[24]，并能夠緩解慢性腎病患者向末期腎病的發展[17]。同時，抗氧化劑治療還可以改善慢性腎病患者晚期透析時腎臟組織內過度的氧化應激所造成的組織損傷[25]。

在正常生理狀態下，生命體中的內源性抗氧化物質如抗氧化酶（CAT、SOD、GSH-Px和GST）以及非酶性GSH可以有效地對抗氧化應激損傷對機體造成的傷害。例如，SOD可以將細胞內多余的超氧陰離子轉化為H2O2，且生成的H2O2可以被CAT和GSH-Px轉化為無害的水[26]。此外，GSH-Px還可以利用GSH作為底物來還原H2O2和烷氫過氧化物，并可將有機氫過氧化物（ROOH）還原為羥基化合物（ROH）[27]。同時，GST則可以協助GSH-Px清除體內過多的ROOH。本研究發現，經不同質量濃度SSE預先保護后，受損細胞內的主要抗氧化酶（CAT、SOD、GSH-Px）活力和γ-GCS含量升高，非酶抗氧化物質GSH含量也得到上升。提升CAT和SOD活力有助于防止氧化應激給LLC-PK1細胞所造成的損傷，并能抑制氧化應激對生物體細胞膜上脂類物質所造成的脂質過氧化反應，并可以緩解氧化應激損傷給細胞所帶來的進一步損傷[28-30]。作為機體內的一種主要的非酶類抗氧化劑，GSH不僅可以直接通過GSH-Px還原毒性的脂質過氧化物和H2O2，還可以間接地抑制體內自由基鏈式反應，避免細胞因自由基所導致的損傷[26,30]。γ-GCS是GSH體內生物合成的限速酶，可促進GSH的合成。此外，芝麻醬油還能上調受損的LLC-PK1細胞中主要抗氧化酶mRNA的轉錄水平。通過增強細胞內CAT和GSH-Px的轉錄水平有助于提高細胞內總銅/鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn SOD）的活性，可減緩細胞的氧化應激損傷[20,28-30]。本實驗為芝麻醬油作為具有抗氧化能力的保健食品提供了一定的理論依據。但由于本次實驗研究僅涉及到細胞層面的體外實驗，而對于對芝麻醬油在氧化應激下保護細胞免受氧化損傷的具體分子生物學機制以及其在體內的抗氧化保護機制，還有待進一步的深入研究。

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Protective Effect of Korean Sesame Sauce on AAPH-Induced Oxidative Stress in LLC-PK1 Cells

ZHAO Xin1, YI Ruokun1, FENG Xia1, SONG Jiale2,3,*
(1. Chongqing Collaborative Innovation Center for Functional Food, Chongqing Engineering Research Center of Functional Food, Chongqing Engineering Laboratory for Research and Development of Functional Food, College of Biological and Chemical Engineering, Chongqing University of Education, Chongqing 400067, China;2. Department of Food Hygiene and Nutrition, School of Public Health, Guilin Medical University, Guilin 541004, China;3. Department of Food Science and Nutrition, Pusan National University, Busan 609-735, Korea)

The present study aimed to investigate the protective effect of ethanol extract from sesame sauce (SSE) on 2,2’-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride (AAPH)-induced oxidative stress in pig renal epithelial LLC-PK1 cells.LLC-PK1 cells were incubated with different concentrations of SSE (10–100 μg/mL) for 24 h, and then exposed to AAPH(1 mmol/L) for 4 h. Cell viability was determined by methyl thiazolyl tetrazolium assay. The levels of malondialdehyde (MDA)and reactive oxygen species (ROS) were determined by thiobarbituric acid reactive substances assay (TBARS) and DCFHDA assay, respectively. The activities of cellular antioxidant enzymes including catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD),glutathione peroxidase (GSH-Px), glutathione S-transferase (GST), γ-glutamylcysteine synthetase (γ-GCS) and glutathione(GSH) were measured by colorimetric assay. In addition, the mRNA levels of these antioxidant enzymes (SOD,GSH-Px and CAT) were determined by quantitative real-time polymerase chain reaction assay. SSE was able to increase cell viability, and decrease ROS and MDA level, as well as increase the activities and mRNA expressionof antioxidant enzymes (CAT、SOD and GSH-Px) compared with the control group. SSE treatment also increased the activity of γ-GCS and GSH levels in AAPH-treated LLC-PK1 cells. These results suggested that SSE showed a protective effect against AAPH-induced oxidative stress in LLC-PK1 cells through inhibiting lipid peroxidation,deceasing ROS levels, and increasing the activity of the endogenous antioxidant system.

sesame sauce; oxidative damage; antioxidant; LLC-PK1 cells

2016-09-09

重慶高校創新團隊建設計劃資助項目（CXTDX201601040）；

重慶市工程技術研究中心建設項目（cstc2015yfpt_gcjsyjzx0027）

趙欣（1981—），男，教授，博士，研究方向為食品營養學和食品化學。E-mail：zhaoxin@cque.edu.cn

*通信作者：宋家樂（1983—），男，副教授，博士，研究方向為分子營養學和功能性食品學。E-mail：songjiale@glmc.edu.cn

10.7506/spkx1002-6630-201723034

TS201.4

A

1002-6630（2017）23-0213-06引文格式：

趙欣, 易若琨, 馮霞, 等. 韓國產芝麻醬油對AAPH誘發LLC-PK1細胞氧化應激的保護作用[J]. 食品科學, 2017, 38(23):213-218.

10.7506/spkx1002-6630-201723034. http://www.spkx.net.cn

ZHAO Xin, YI Ruokun, FENG Xia, et al. Protective effect of Korean sesame sauce on AAPH-induced oxidative stress in LLC-PK1 cells[J]. Food Science, 2017, 38(23): 213-218. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201723034. http://www.spkx.net.cn