酶催化合成L-茶氨酸的研究進展

李 元，劉 珊，祝 俊

（中國科學院天津工業生物技術研究所，天津 300308）

酶催化合成L-茶氨酸的研究進展

李 元，劉 珊，祝 俊*

（中國科學院天津工業生物技術研究所，天津 300308）

L-茶氨酸是茶葉中的特征氨基酸，具有改善食品風味、放松減壓、增強抗腫瘤藥物療效等多種功能。本文介紹了L-茶氨酸的生理功能及其在食品、保健品和醫藥領域中的應用，并重點對L-茶氨酸的酶法合成進行了綜述，在此基礎上探討了工業化生產L-茶氨酸的未來可能的研究方向，以期為利用酶法實現L-茶氨酸的工業化生產提供參考依據。

茶葉；L-茶氨酸；生物合成；酶

L-茶氨酸（L-theanine）屬于酰胺類化合物，分子式為C7H14N2O3，是茶葉中含量最豐富的游離氨基酸，占總游離氨基酸含量的50%以上。它是茶葉香味和口感的主要成分，因此它的含量多少對茶葉的風味和品質起到關鍵性的作用。大量研究結果表明L-茶氨酸具有多種重要的生理功能[1]，因而被廣泛應用于食品、保健品及醫藥行業中。

L-茶氨酸可從茶葉中提取分離[2-3]，但其僅占茶葉干質量的1%～2%[4]；另外，由于缺乏簡便、特異和高效的分離方法，高純度L-茶氨酸的提取分離通常涉及耗時、高成本和復雜的操作過程，不利于工業化生產。與此相反，化學法[5-6]合成L-茶氨酸具有方法簡單、成本低、產率高等優點，但是合成的茶氨酸為L-和D-形式的外消旋混合物，通常被認為是“非天然”產物，其安全性評價亟待研究。

近年來，隨著生物工程技術的發展，L-茶氨酸的生物合成[7-11]備受關注。目前應用于L-茶氨酸合成的生物酶主要有L-谷氨酰胺酶、γ-谷氨酰轉肽酶（γ-glutamyltranspeptidase，GGT）、L-谷氨酰胺合成酶（L-glutamine synthetase，GS）、γ-谷氨酰甲胺合成酶（γ-glutamylmethylamide synthetase，GMAS）和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamylcysteine synthetase，γ-GCS）。本文結合本課題組的前期工作，參考近年來國內外有關文獻對L-茶氨酸的生理功能及應用現狀進行了概述，并著重綜述了L-茶氨酸酶催化合成方法的研究進展，探討了未來可能的研究方向和方法，以期為L-茶氨酸的研究開發和綜合利用提供理論依據，并為其生物合成的工業化生產提供參考依據。

1 L-茶氨酸的生理功能及應用現狀

L-茶氨酸具有多種重要的生理功能，如：通過調節腦中神經傳達物質的濃度降低血壓[12]；與抗腫瘤藥物并用時，增強抗腫瘤藥物的抗癌效果，并減少抗腫瘤藥物的副作用[13]；抑制短暫腦缺血引起的神經細胞死亡，對神經細胞有保護作用[14-15]；影響腦中多巴胺等神經傳達物質的代謝和釋放，從而改善認知能力和提高學習能力[16]、放松減壓并緩解焦慮[17]；提高免疫力[18]；減肥作用[19]等。

L-茶氨酸作為一種安全、集多種生理功能于一體的功能性活性因子，被廣泛應用于食品、保健品和醫藥行業。在食品行業，由于具有優良的加工特性和穩定性，L-茶氨酸主要用作茶飲料、食品的風味改良劑和功能性食品的添加劑[20]，如美國達拉斯VIB Holdings LLC公司生產的以L-茶氨酸為添加劑的安神飲料Vacation in a Bottle。在保健品行業，L-茶氨酸作為天然鎮靜劑、抗抑郁劑在國外市場上大受歡迎，日本、美國市場上已有多種不同品牌的茶氨酸保健產品[21]，如美國保健品牌Doctor’s Best的L-茶氨酸膠囊；然而，在國內L-茶氨酸主要是銷往國外，國內基本沒有茶氨酸類的保健品上市。在醫藥行業，L-茶氨酸可開發為治療腫瘤的輔助藥物、降壓藥物或可用于安神鎮靜藥物中等，目前日本已經把L-茶氨酸作為有效成分用于鎮靜劑中。近年來，L-茶氨酸生理功能和藥理藥效實驗的研究表明其在保健品和醫藥領域中具有巨大的應用價值和廣闊的開發前景。

2 生物體內L-茶氨酸的合成

在茶樹中，L-茶氨酸合成酶（theanine synthetase，TS）在ATP供能的條件下，催化L-谷氨酸和乙胺合成L-茶氨酸[22]，如圖1所示。Sasaoka等[23]對TS的性質進行了研究，結果表明該酶為茶樹特有的合成酶，對乙胺具有高親合力，然而其非常不穩定并且難以分離，不適宜體外合成L-茶氨酸，因此限制了其在L-茶氨酸體外合成中的應用。

圖1 茶樹中L-茶氨酸的生物合成[24]Fig. 1 Biosynthesis of L-theanine in the tea plant[24]

3 酶催化體外合成L-茶氨酸

隨著基因工程技術的深入開展，研究人員對酶促體外合成L-茶氨酸進行了不斷地探索和技術創新。目前，用于L-茶氨酸體外合成的酶如圖2所示，主要包括：1）以L-谷氨酰胺為底物、基于γ-谷氨酰轉移反應的酶：L-谷氨酰胺酶和GGT；2）以L-谷氨酸為底物、需ATP供能的合成酶：GS、GMAS和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶γ-GCS。L-谷氨酰胺酶和GGT催化L-谷氨酰胺和乙胺合成L-茶氨酸；GS、GMAS和γ-GCS在ATP存在條件下催化L-谷氨酸和乙胺合成L-茶氨酸。

圖2 酶催化合成L-茶氨酸Fig. 2 Biosynthesis of L-theanine by various enzymes

3.1 L-谷氨酰胺酶催化L-茶氨酸合成

L-谷氨酰胺酶是一種酰胺基水解酶[25]，催化L-谷氨酰胺的γ-酰胺鍵水解為L-谷氨酸和游離氨（圖3A），在原核和真核生物中廣泛分布。此外，一些L-谷氨酰胺酶還可催化L-谷氨酰胺的γ-谷氨酰基的轉移反應，例如來自硝基還原假單胞菌Pseudomonas nitroreducens的L-谷氨酰胺酶[26]，其可催化羥胺、甲胺和乙胺作為受體分子的轉移反應，如圖3B所示，其中當乙胺作為受體分子時形成L-茶氨酸。Tachiki[27]和Pu Hefang[28]等分別對天然形式的來自菌株P. nitroreducensIFO 12694的L-谷氨酰胺酶和重組形式的來自菌株P. nitroreducensDSM14399的L-谷氨酰胺酶進行了深入研究，其催化合成L-茶氨酸的反應條件如表1所示。

圖3 L-谷氨酰胺酶催化的反應[25]Fig. 3 Reactions catalyzed by L-glutaminase[25]

為了增強L-谷氨酰胺酶的穩定性和可復用性，Yokoyama等[29]使用介孔二氧化硅（mesoporous silica，MPS）作為固定化載體對菌株IFO 12694的L-谷氨酰胺酶進行了固定化，并通過用氧化鋯表面修飾提高MPS在高pH值下的穩定性，從而改善固定化酶對于L-茶氨酸生產的可復用性。Itoh等[30]使用碳包覆MPS的孔表面也獲得了類似的效果。此外，Matsuura等[31]開發了包含L-谷氨酰胺酶-MPS組合物的流動型微反應器，可用于連續合成L-茶氨酸。

表1 各種來源L-谷氨酰胺酶催化合成L-茶氨酸方法的比較Table 1 Comparative analysis of the methods available for enzymatic synthesis of L-theanine using L-glutaminase from various sources

除了P. nitroreducens外，來自香茅醇假單胞菌P. citronellosis GEA FERM BP-8353所衍生的L-谷氨酰胺酶也可合成L-茶氨酸[32]。該菌株為日本太陽化學株式會社研究人員從土壤中分離出的一種新細菌。使用P. citronellosis GEA的無細胞提取物合成L-茶氨酸時，在0.3 mol/L L-谷氨酰胺和0.9 mol/L乙胺時反應最佳，30 ℃、pH 11.0孵育48 h后，轉化率達到約55%。

3.2 GGT催化L-茶氨酸合成

圖 4 GGT催化的反應[33]Fig. 4 Reactions catalyzed by GGT[33]

GGT催化γ-谷氨酰化合物的γ-谷氨酰基部分轉移到其他氨基酸和短肽上[33]（圖4A），當水作為γ-谷氨酰基受體時，其催化γ-谷氨酰化合物的水解（圖4B）。

GGT廣泛存在于從細菌到哺乳動物的一系列生物體中。相比哺乳動物，細菌GGT具有更廣泛的底物特異性，目前用于L-茶氨酸合成的GGT均來自于細菌。2002年，Suzuki等[34]首次發現來自大腸桿菌Escherichia coli K-12的GGT可催化γ-谷氨酰胺和乙胺生成L-茶氨酸，轉化率為60%。隨后研究者們對使用來自E. coli[35-39]、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis[40-43]和地衣芽孢桿菌B. licheniformis[44]的GGT催化合成L-茶氨酸進行了深入研究，如表2所示。

理論上，GGT催化合成L-茶氨酸可使用各種γ-谷氨酰基供體，其轉肽活性隨γ-谷氨酰基供體而變化。例如，來自B. licheniformis的GGT以L-谷氨酰胺作為γ-谷氨酰基供體時，相對活力是以GAME作為供體的4.4 倍[45]；相反地，當使用GMAE代替L-谷氨酰胺作為供體時，來自E. coli K-12的GGT的相對活力增加1.2 倍[36]。當以GAME為γ-谷氨酰基供體時，使用含有GGT的E. coli全細胞催化L-茶氨酸合成轉化率可達95%[36]；使用固定化的含有GGT的E. coli全細胞催化L-茶氨酸合成，在使用6 次后，平均轉化率可達87.2%[37]。2013年，Zhang Hongjuan等[39]報道了利用各種取代的γ-谷氨酰基苯胺為γ-谷氨酰基供體，使用來自E. coli的GGT催化合成L-茶氨酸。

與L-谷氨酰胺酶相似，通過GGT催化合成L-茶氨酸時，無需ATP參與；然而通常需要使用較高濃度的乙胺和優化反應pH值以抑制底物L-谷氨酰胺的水解和因自轉肽作用形成γ-谷氨酰-谷氨酰胺副產物。為了減少通過GGT生物合成L-茶氨酸期間的底物水解和自轉肽副反應，Wang Haoqi等[41]使用其中游離α-氨基和羧基被Zn封閉的L-谷氨酰胺-Zn（Ⅱ）絡合物代替L-谷氨酰胺作為底物，其L-茶氨酸產率增加了16.9%。

表2 各種來源GGT催化合成L-茶氨酸方法的比較Table 2 Comparative analysis of the methods available for enzymatic synthesis of L-theanine using GGT from various sources

表3 各種來源GS和GMAS酶學性質的比較Table 3 Comparative enzymatic characterization of GS and GMAS from various sources

3.3 GS催化L-茶氨酸合成

GS在ATP存在條件下，催化L-谷氨酸鹽和游離氨轉化為L-谷氨酰胺。Tachiki等[46-47]首次對來自谷氨酸微球菌Micrococcus glutamicus ATCC 13032的GS催化L-谷氨酸和乙胺合成L-茶氨酸進行了報道。隨后，Yamamoto等[48]對來自腐臭假單胞菌Pseudomonas taetrolens Y-30菌株的GS進行了純化及酶學性質研究，經表征其具有生產L-茶氨酸的能力；該來源編碼GS的基因已在E. coli中成功表達，重組的GS顯示與天然GS具有相同的性質，且該酶在表達系統中的生產能力比在原始細菌P. taetrolens Y-30中高約30 倍[49]。在GS催化L-茶氨酸合成時，需要ATP參與，因此該課題組將“偶聯發酵與能量轉移”的酵母糖酵解ATP再生系統應用于GS生物合成L-茶氨酸中，反應體系經過優化后，200 mmol/L L-谷氨酸可產生170 mmol/L L-茶氨酸[50]。此外，Zhou Xin等[51]研究表明來自B. subtilis的GS能在E. coli BL21（DE3）/pET28a-glnA細胞中作為可溶性蛋白高效表達（約占總蛋白的86%）；在pH 7.5和Mn2+濃度為10 mmol/L條件下，重組GS具有最大的L-茶氨酸合成活力（6.4 U/mg）。

3.4 GMAS催化L-茶氨酸合成

GMAS在ATP供能的條件下催化L-谷氨酸和甲胺合成γ-谷氨酰甲胺（γ-glutamylmethylamide，γ-GMA）；對于依賴甲胺作為單獨的碳源和氮源的細菌，GMAS在甲胺代謝中間體γ-GMA的生物合成中發揮著重要作用[52]。相比GS，其對乙胺顯示出更高的活性，各種來源的GMAS和GS酶學性質的比較如表3所示。

1 9 9 2年，K i m u r a等[53]首次從噬甲基菌株Methylophaga sp. AA-30中純化出GMAS，該酶在pH 7.5 和40 ℃條件下有最大活性，表現出較寬的底物特異性范圍，并能以乙胺和L-谷氨酸為底物催化合成L-茶氨酸，但未進行深入研究。2007年，Yamamoto等[54]從200多種甲胺和/或甲醇同化細菌中篩選出M. mays No. 9作為L-茶氨酸生產菌，并從中分離出GMAS，該酶在中性pH值范圍對乙胺具有較高的活性；同時在較低底物濃度條件下，該酶催化的L-茶氨酸產量高于P. taetrolens Y-30 GS大約20 倍。隨后該課題組將M. mays No. 9中編碼GMAS的基因在E. coli中進行了重組表達，結果表明重組菌的產酶能力可比原始M. mays No. 9高23 倍，而重組GMAS的酶學性質與天然GMAS無明顯不同[55]，這使得大量生產GMAS用于工業L-茶氨酸生產成為可能；以重組GMAS作為催化劑，研究了偶聯酵母糖酵解ATP再生的L-茶氨酸生物合成，結果表明含600 mmol/L L-谷氨酸鈉、600 mmol/L鹽酸乙胺、300 mmol/L葡萄糖、200 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 7.0）、30 mmol/L MgCl2、5 mmol/L MnCl2、5 mmol/L單磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）、30 U/mL GMAS 和40 g/L 酵母細胞的1 mL混合體系中，在48 h內可催化合成約110 g/L L-茶氨酸[56]。另外，該課題組將GMAS和酵母干細胞封閉于透析膜管中，該膜封閉酶制備法可實現600 mmol/L L-谷氨酸和乙胺100%轉化為L-茶氨酸，且在含NAD+混合反應液中經6 次連續反應仍能保持較高的L-茶氨酸生產能力[57]。

與L-谷氨酰胺酶和GGT相比，GMAS在催化L-茶氨酸合成時，以廉價的L-谷氨酸鹽為原料，只需要添加等當量的乙胺，而無需考慮L-谷氨酰胺為底物時由于其水解及自轉肽反應帶來的副產物問題。然而，與GS相似，GMAS在催化L-茶氨酸的合成中是需要ATP參與的，ATP再生是關系到GMAS用于工業化生產L-茶氨酸的關鍵。鑒于重組GMAS在L-茶氨酸合成中所表現出的優勢，本課題組開發了偶聯基于磷酸激酶（polyphosphate kinase，PPK）的ATP再生系統的酶法L-茶氨酸合成路線[58]，如圖5所示，通過PPK催化，以廉價易得的多聚磷酸鹽（polyphosphate，polyP）為底物實現ATP再生，在200 mL反應體系中，添加催化量的ATP，以400 mmol/L L-谷氨酸和乙胺為底物，實現了L-茶氨酸84%的產率。該反應體系基于酶法ATP再生，相比酵母糖酵解ATP再生，體系簡單易控，有利于工業化生產L-茶氨酸，相關反應體系比較如表4所示。

表4 各種來源GS和GMAS催化合成L-茶氨酸方法的比較Table 4 Comparative analysis of the methods available for enzymatic synthesis of L-theanine using GS and GMAS from various sources

圖5 偶聯基于PPK ATP再生酶法合成L-茶氨酸[58]Fig. 5 Enzymatic synthesis of L-theanine by GMAS coupled with an ATP regeneration system based on PPK[58]

3.5 GCS合成酶催化L-茶氨酸合成

γ-GCS在ATP供能條件下，以L-谷氨酸和L-半胱氨酸為底物催化合成γ-谷氨酰半胱氨酸，是生物體內合成谷胱甘肽的重要用酶[59]。Miyake等[60]報道了來自E. coli的γ-GCS具有催化L-谷氨酸和脂肪胺類生成γ-谷氨酰胺類化合物的能力，且反應速度與亞甲基長度有關（正丙胺＞丁胺＞乙胺＞＞甲胺）；利用重組E. coli DH5α/pGSK1表達的γ-GCS催化，并偶聯E. coli自身ATP再生系統，18 h后能以429 mmol/L乙胺合成12.1 mmol/L L-茶氨酸。然而，該酶對乙胺的底物特異性較差，需要對其進行進一步改造，以提高其底物特異性。

4 結 語

L-茶氨酸因其獨特的生物學功能，在食品、保健品、醫藥等領域必將有著巨大的應用價值和廣闊的開發前景，所以實現L-茶氨酸的工業化生產尤為重要。由于高效、節能、環境友好等優點，酶催化合成L-茶氨酸日益受到青睞。目前L-茶氨酸的酶法合成已經取得一定進展，但仍存在一些問題：1）使用L-谷氨酰胺酶和GGT催化L-谷氨酰胺及衍生物與乙胺合成L-茶氨酸，反應過程中不需要ATP參與，然而需要使用過量乙胺并在堿性條件下反應，以抑制底物L-谷氨酰胺水解及自轉肽作用；另外，還存在底物濃度偏低和轉化效率不高的問題。2）使用GS、GMAS及γ-GCS催化L-谷氨酸與乙胺合成L-茶氨酸，不存在底物水解及自轉肽等副反應，然而反應過程需要ATP參與，使得ATP再生成為此類酶，特別是GMAS，應用于L-茶氨酸工業生產的關鍵問題。因此，可從以下幾個方面進行深入研究：1）進一步表征這些酶的晶體結構，從而更完善地闡明乙胺結合以及通過γ-谷氨酰基的轉移或L-谷氨酸的連接生物合成L-茶氨酸的分子機制，以更好地利用定向進化技術提高酶對乙胺的底物特異性、催化活性和穩定性，進一步提高合成L-茶氨酸的效率。2）利用生物信息學中的基因挖掘技術從自然界中篩查和表征更多具有催化L-茶氨酸合成功能的酶，并比較其酶性質和合成L-茶氨酸的能力，以開發更有效的酶用于L-茶氨酸的工業生產。3）開發更高效的ATP再生系統，以解決GMAS等酶在工業化生產應用中的瓶頸問題。

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Process in Enzymatic Synthesis of L-Theanine

LI Yuan, LIU Shan, ZHU Jun*(Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China)

L-theanine (γ-glutamylethylamide), a unique non-protein-derived amino acid in tea, has a broad range of bioactivities, such as improving food fl avor, releasing pressure and enhancing the eff i ciency of anticancer agents. Herein,the physiological and pharmacological activities of L-theanine and its applications in food, health and medical industries are summarized with focus on the enzymatic synthesis of L-theanine. Moreover, directions for future research are also discussed in the hope of providing a guideline for the large-scale industrial production of L-theanine.

tea; L-theanine; biosynthesis; enzyme

10.7506/spkx1002-6630-201723047

TS202.3

A

1002-6630（2017）23-0298-07

李元, 劉珊, 祝俊. 酶催化合成L-茶氨酸的研究進展[J]. 食品科學, 2017, 38(23): 298-304.

10.7506/spkx1002-6630-201723047. http://www.spkx.net.cn

LI Yuan, LIU Shan, ZHU Jun. Process in enzymatic synthesis of L-theanine[J]. Food Science, 2017, 38(23): 298-304. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201723047. http://www.spkx.net.cn

2016-09-09

天津市科技計劃項目（14ZCZDSY00064）

李元（1986—），女，助理研究員，碩士，研究方向為生物催化。E-mail：li_yuan@tib.cas.cn

*通信作者：祝俊（1962—），男，研究員，博士，研究方向為酶工程與生物催化。E-mail：zhu_j@tib.cas.cn