杉木天冬酰胺合成酶基因的克隆與生物信息學分析

薛爽+董毅+饒麗莎+許珊珊+林思祖

摘 要：為了解杉木天冬酰胺合成酶基因（ASN）的相關信息，以杉木組培苗105為材料，克隆獲得杉木ASN3基因，該基因為一個完整的開放閱讀框，共編碼231個氨基酸，生物信息學分析顯示：ASN3基因編碼蛋白為不含卷曲螺旋結構和信號肽的非跨膜穩定親水蛋白，定位于微體（過氧化物酶體），具有多樣的磷酸化位點，其中絲氨酸15個，蘇氨酸7個，酪氨酸3個，其二級及三級結構主要由無規則卷曲和α-螺旋組成。

關鍵詞：杉木；天冬酰胺合成酶基因；克隆；生物信息學

中圖分類號 S791.27 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）22-0028-03

Abstract：In order to understand the relevant information of ASN gene of Cunninghamia lanceolata，ASN3 gene which was a complete open reading frame with encoding 231 amino acids was cloned from tissue culture seedling 105 of Cunninghamia lanceolata.According to bioinformatics analysis， protein encoded by ASN3 gene was stable and closed to water， without the signal peptide， winded helix and transmembrane domain， located in microbody（peroxisome） and had a variety of phosphorylation sites， with 15 serine， 7 threonine and 3 tyrosine.The secondary structures and three-dimensional structure of ASN3 gene were mainly composed of random coil and alpha helix.

Key words：Cunninghamia lanceolata；ASN gene；cloning；Bioinformatics analysis

天冬酰胺合成酶是廣泛存在于植物體內的一類由小基因家族編碼的氨基轉移酶，主要以氨或谷氨酰胺及天冬氨酸為底物催化合成天冬酰胺。根據其底物的不同，天冬酰胺合成酶可分為AS-A和AS-B，前者為氨依賴性，僅存于原核生物；后者為谷氨酰胺依賴性，廣泛存在于原核和真核生物[1]。因此，普遍認為植物天冬酰胺主要由AS-B催化合成。目前，已從大豆[2-3]、小黑楊[4]、玉米[5]、海岸松[6-8]、桑樹[9]、小黑麥[10]、向日葵[11]等多種植物中成功分離ASN基因，且進一步的功能研究發現ASN基因具有一定的抗逆功能。杉木作為我國南方重要的造林樹種，已成功分離出一個ASN1基因[12]，本研究將在此基礎上進一步分離杉木ASN基因其他新成員，以期為后續系統研究ASN基因在杉木生長發育及逆境過程中的調控作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 供試材料為國家林業局杉木工程技術研究中心保存的杉木組培苗105。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和cDNA合成 參考官清娜[12]方法進行杉木總RNA提取，經酶標儀和瓊脂糖凝膠（1%）檢測合格的RNA用于cDNA合成。根據TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒（TIANGEN）說明書反轉錄cDNA。

1.2.2 引物設計與PCR擴增 將已擴杉木ASN1基因序列與杉木轉錄組中預測的ASN基因序列比對，設計上游引物5-ATGAAAGCTTTGCACGATGACTG-3和下游引物5-TTAACCCTGAATGACAACTCCCCT-3用于PCR擴增。擴增反應程序：94℃預變性3min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，35個循環；72℃延伸7min。將PCR擴增產物送北京六合華大基因生物技術公司測序。

1.2.3 生物信息學分析 利用在線軟件對目的基因所編碼蛋白的理化性質（ExPASy）、信號肽（SignaIP 4.1 Server）、跨膜結構（ExPASy）、亞細胞定位（PSORT）、磷酸化位點（NetPhos 2.0 Sever）、卷曲螺旋結構（EMBnet Coils）、二級結構（GOR IV）和三級結構（SWISSMODEL）進行預測和分析。

2 結果與分析

2.1 杉木ASN基因新成員的cDNA序列的獲得 根據所設引物進行PCR擴增，經電泳后發現有兩條條帶，分別是1300bp和700bp，經PCR產物直接測序后，只得到一條696bp的序列，經DNAMAN軟件翻譯后，發現該轉錄本含有起始密碼子ATG和終止密碼子TAA，可完整編碼，為一個完整的編碼框，共編碼231個氨基酸。將該轉錄本的核苷酸序列及其翻譯的氨基酸序列在NCBI上進行在線比對，顯示該轉錄本與海岸松（HQ625490.1）、樟子松（AJ496567.2）及落葉松（KF515226.1）等已登錄物種的ASN基因高度同源，表明該轉錄本為杉木ASN基因新成員，命名為ASN3，其所編碼的氨基酸序列如下：

MKALHDDCLRANKSTSAWGLEARVPFLDKEFINVAMDIDPDWKMVRPDQGRIEKWILRKAFDDKENPYLPQHILYRQKEQFSDGVGYSWIDGLKAHAAEHVSDMMLMNAKYVFPHNTPSTKEAFYYRMIFERFFPQNAARLTVPGGPSVACSTAKAVEWDAAWSNHLDPSGRAALGVHASAYKDKDKLSSSSSHSNLPLLTVTAGLGTSLDKSPGPLMGDPLTARGendprint

VVIQG.

2.2 杉木ASN3基因的生物信息學分析 蛋白質是生命的物質基礎，其氨基酸序列、空間結構、修飾基團等決定了其相應的蛋白功能。因此，利用蛋白質分析軟件對ASN3基因編碼蛋白質的理化性質、蛋白結構、翻譯后磷酸化修飾進行分析，有助于推斷其功能和作用機理，為后續的功能分析和作用機理研究提供依據。

2.2.1 ASN3蛋白理化性質分析 利用在線軟件ExPASy對ASN3蛋白進行理化性質分析，結果顯示，該蛋白分子式為C1148H1770N316O335S10，相對分子質量為25679.20Da，由20種氨基酸組成，其中丙氨酸所占比例最大，為10.4%；該蛋白帶27個正電荷（Asp+Glu）和27個負電荷（Arg+Lys），pI等電點為7.09；不穩定系數和親水性分別為34.79和-0.397，為穩定的親水蛋白。進一步利用ExPASy和SignaIP 4.1軟件對ASN3蛋白的跨膜結構及信號肽進行分析，結果顯示，ASN3蛋白不具有跨膜結構和信號肽，屬于非分泌蛋白。亞細胞定位（PSORT）分析顯示ASN3蛋白定位于微體（過氧化物酶體）的可能性最大，分值為0.657。

2.2.2 ASN3蛋白結構特征分析 利用EMBnet Coils軟件對ASN3蛋白質卷曲螺旋進行預測，結果表明，以window=14、21和28為參數，ASN3蛋白在整個肽鏈上不存在卷曲螺旋結構。二級結構分析顯示該蛋白含有55.41%的無規則卷曲、32.9%的α-螺旋和11.69%的延伸鏈（圖1）。三級結構分析結果（圖2）和二級結構分析結果相似，表明該蛋白主要由無規則卷曲和α-螺旋組成。

2.2.3 翻譯后磷酸化修飾分析 利用NetPhos 2.0 Sever對ASN3蛋白潛在的磷酸化位點進行分析，結果顯示該蛋白共有25個磷酸化位點，其中絲氨酸磷酸化位點15個，蘇氨酸磷酸化位點7個，酪氨酸磷酸化位點3個（圖3）。

3 結論與討論

ASN參與植物體內氮從源組織到庫組織的重新定位[13]，是植物體氮代謝過程中的關鍵酶。本試驗成功分離杉木ASN3基因，該基因為一個完整的編碼框，共編碼231個氨基酸，對其所編碼的蛋白進行生物信息學分析，發現該蛋白為不含卷曲螺旋結構和信號肽的非跨膜穩定親水蛋白，具有多樣的磷酸化位點，其中絲氨酸15個，蘇氨酸7個，酪氨酸3個，推測其可能以絲氨酸磷酸化為主和蘇氨酸磷酸化為輔的方式影響杉木生長發育過程中ASN酶活性及分子構象，進而參與調控杉木的生長發育。

參考文獻

[1]Gaufichon L， Reisdorf-Cren M， Rothstein S J， et al.Biological functions of asparagine synthetase in plants[J].Plant Science， 2010， 179（3）： 141-153.

[2]張繼， 王相晶， 于丹， 等.大豆天冬酰胺合成酶 β 基因的克隆及在大腸桿菌中的表達[J].東北農業大學學報， 2013， 44（7）： 17-21.

[3]Wan T F， Shao G H， Shan X C， et al.Correlation between AS1 gene expression and seed protein contents in different soybean （Glycine max [L.]Merr.） cultivars[J].Plant Biology， 2006， 8（02）： 271-276.

[4]郝丙青.小黑楊天冬酰胺合成酶基因AS功能的研究[D].哈爾濱：東北林業大學， 2016.

[5]Todd J， Screen S， Crowley J， et al.Identification and characterization of four distinct asparagine synthetase （AsnS） genes in maize （Zea mays L.）[J].Plant science， 2008， 175（6）： 799-808.

[6]Ca?as R A， de la Torre F， Cánovas F M， et al.Coordination of PsAS1 and PsASPG expression controls timing of re-allocated N utilization in hypocotyls of pine seedlings[J].Planta， 2007， 225（5）： 1205-1219.

[7]Canales J， Rueda-López M， Craven-Bartle B， et al.Novel insights into regulation of asparagine synthetase in conifers[J].Frontiers in plant science， 2012， 3.

[8]Canas R A， de la Torre F， Canovas F M， et al.High levels of asparagine synthetase in hypocotyls of pine seedlings suggest a role of the enzyme in re-allocation of seed-stored nitrogen[J].Planta， 2006， 224（1）： 83-95.

[9]潘寶華， 潘剛， 方榮俊， 等.桑樹天冬酰胺合成酶基因的克隆與表達分析[J].蠶業科學， 2011， 37（1）： 1-8.

[10]張曉磊.小黑麥天冬酰胺合成酶基因克隆及功能驗證[D].石河子：石河子大學， 2013.

[11]程維舜.植物天冬酰胺合成酶基因的抗病性調控功能分析[D].杭州：浙江大學， 2011.

[12]官清娜.杉木天冬酰胺合成酶基因的克隆與表達分析[D].福州：福建農林大學，2015.

[13]Lam H M， Wong P， Chan H K， et al.Overexpression of the ASN1 gene enhances nitrogen status in seeds of Arabidopsis[J].Plant physiology， 2003， 132（2）： 926-935.

（責編：施婷婷）endprint