響應面法優化靈芝發酵培養基及發酵活性成分分析

孔祥輝，楊國力，高 洋，陳喜君，王 輝，馬銀鵬，陳 丹，陳 鶴，陳靜宇

（1.黑龍江省科學院微生物研究所，黑龍江哈爾濱 150010；2.黑龍江省科學院高技術研究院，黑龍江哈爾濱 150001；3.黑龍江眾生生物工程有限公司，黑龍江哈爾濱 150028；4.哈爾濱商業大學，黑龍江哈爾濱 150076）

響應面法優化靈芝發酵培養基及發酵活性成分分析

孔祥輝1，2，楊國力3，高 洋4，*陳喜君3，王 輝3，馬銀鵬1，陳 丹3，陳 鶴1，陳靜宇1

（1.黑龍江省科學院微生物研究所，黑龍江哈爾濱 150010；2.黑龍江省科學院高技術研究院，黑龍江哈爾濱 150001；3.黑龍江眾生生物工程有限公司，黑龍江哈爾濱 150028；4.哈爾濱商業大學，黑龍江哈爾濱 150076）

以靈芝液體發酵菌絲量和胞外多糖含量為評價指標，確定靈芝菌液體發酵最優培養基配方，分析了菌絲體和發酵液中的活性成分。結果表明，靈芝液體發酵最優配方為黃豆粉添加量1.63%，葡萄糖添加量2.33%，可溶性淀粉添加量3%，磷酸二氫鉀添加量0.1%，硫酸鎂添加量0.05%，VB1添加量50 mg/L，菌絲體干質量最高達1.94 g/100 mL；發酵液中的胞外多糖質量濃度為431 mg/100 mL；菌絲體胞內多糖質量分數達15.37%，總三萜質量分數達1.36%，蛋白質質量分數為22.93%，多酚質量分數為1.91%。

靈芝；菌絲體；活性成分；胞內多糖；胞外多糖

靈芝（Ganoderma lucidum） 又稱神芝、仙草、瑞草，是擔子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌，自古以來就是我國珍貴的藥食兩用菌，具有抗癌、降血壓、免疫調節、降血糖、保肝、排毒、抑制組胺釋放等功效[1]，市場需求量與日俱增。靈芝活性成分主要為靈芝多糖、三萜類、靈芝多肽等，但成分含量會因所用菌種、菌種產地、栽培方法、提取工藝、制劑方法不同而不同[2]。傳統靈芝藥用方式是以子實體或孢子入藥，子實體纖維化、木質化程度高，苦味濃，而靈芝孢子細胞壁厚，不易被人體利用，二者不宜直接作為食品、藥品原料[3]。另外，野生靈芝資源有限，人工栽培靈芝子實體周期較長、成本高，限制了靈芝的廣泛應用。目前，利用發酵技術生產真菌具有容積大、產量高、周期短和無污染等特點，已成為醫藥和保健品、化妝品等原料的重要生產方式[4]。通過液體發酵生產靈芝菌絲體，產品苦味小，營養價值及有效成分不低于子實體，甚至有些指標高于子實體，因而具有廣闊的開發和應用前景[4-6]。試驗采用搖瓶發酵方法，以靈芝發酵菌絲體干質量和胞外多糖含量為指標篩選最優培養基，測定菌絲體胞內多糖、萜類、蛋白質和多酚含量，為靈芝菌絲體及發酵液的深層次開發與利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

靈芝菌株：赤靈芝，由黑龍江省科學院微生物研究所提供。

1.1.2 試驗設備和試劑

UV757CRT型紫外可見光分光光度計，上海精科集團產品；TGL20M-II型離心機，西安莫吉娜儀器制造有限公司產品；RE-53AA型旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠產品；KDN-08C型凱氏定氮消化儀，杭州麥哲儀器廠產品；DP-ZDDN-II型凱氏定氮蒸餾裝置，北京亞歐德鵬科技有限公司產品；SHB-III型循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司產品。

磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸銨、葡萄糖、香草醛、冰醋酸、氯仿、甲醇、異丙醇、硼酸、甲基紅、高氯酸、硫酸銅、硫酸鉀、重蒸酚、硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉為分析純；可溶性淀粉、白砂糖均為化學純；濃硫酸為優級純；酵母膏、蛋白胨、α-淀粉酶、VB1為生物試劑；鄰苯二甲酸氫鉀為基準試劑；溴甲酚綠、酚酞為指示劑；齊墩果酸為分析標準品。

1.2 試驗方法

1.2.1 靈芝菌種活化、擴大培養[7]、菌絲體收集及干質量測定方法

（1）菌種活化培養基：cPDA。

（2） 液體培養基配方。土豆汁添加量20%，麥麩皮添加量5%，可溶性淀粉添加量2%，硫酸鎂添加量0.05%，磷酸二氫鉀添加量0.1%，酵母膏添加量0.2%。

（3）接種。無菌操作臺，用移液槍取2.5 mL靈芝液體菌種接種到裝有100 mL培養基的250 mL錐形瓶中，于28℃，120 r/min條件下培養8 d[8]。4層紗布過濾發酵液，菌絲體蒸餾水洗滌，于80℃下烘干至恒質量，稱量[9]。

1.2.2 碳源對靈芝菌絲體生長量和胞外多糖含量的影響

根據靈芝生理特性，結合生產實踐，選擇玉米粉、可溶性淀粉、土豆、葡萄糖、白砂糖作為碳源，在基準培養基（黃豆粉添加量1.5%，磷酸二氫鉀添加量0.1%，硫酸鎂添加量0.05%，VB1添加量50 mg/L）基礎上，分別研究玉米粉添加量（2%，3%，4%）、土豆添加量（10%，20%，30%）、可溶性淀粉添加量（2%，3%，4%）、葡萄糖添加量（2%，3%，4%）和白砂糖添加量（2%，3%，4%） 對靈芝菌絲體生長量和胞外多糖含量的影響。

1.2.3 氮源對靈芝菌絲體生長量和胞外多糖含量的影響

根據靈芝生理特性，結合生產實踐，選擇黃豆粉、麥麩皮、酵母膏、蛋白胨、硫酸銨作為氮源，在基準培養基（玉米粉添加量3%，磷酸二氫鉀添加量0.1%，硫酸鎂添加量0.05%，VB1添加量50 mg/L）基礎上，分別研究黃豆粉添加量（1.50%，1.75%，2.00%）、麥麩皮添加量（2%，5%，8%）、酵母膏添加量（0.1%，0.3%，0.5%）、蛋白胨添加量（0.1%，0.3%，0.5%） 和硫酸銨添加量（1%，3%，5%） 對靈芝菌絲體生長量和胞外多糖含量的影響。

1.2.4 無機鹽添加量對靈芝菌絲體生長量和胞外多糖含量的影響

以基準培養基（3%玉米粉，1.5%黃豆粉，0.05%硫酸鎂，50 mg/L VB1）研究添加0.05%～0.30%的磷酸二氫鉀對菌絲體生長量和發酵液胞外多糖的影響。

1.2.5 靈芝菌絲體最優配方確定

試驗因素與水平設計見表1。

表1 試驗因素與水平設計/%

由表1可知，29個試驗點為分析因點和零點，其中分析因點取值在X1，X2，X3，X4所構成的三維頂點，2，4，13，16，23為零點試驗，重復5次，零點為區域的中心點，用以估計試驗誤差。按照29個試驗點配方分別做培養基，每組3個平行，依次滅菌、冷卻、接種，于28℃，轉速180 r/min條件下搖動培養8 d。

1.2.6 多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法[10]。

（1） 菌絲體胞內多糖提取、測定。將80℃下烘干的靈芝菌絲體1.0 g，加30倍水，于90℃下浸提1.5 h，以轉速10 000 r/min離心20 min，取上清液1，沉淀加30倍水再次浸提1.5 h，離心取上清液2，將沉淀烘干；上清液1和上清液2合并，加入2 mg α-淀粉酶60℃酶解1 h，加水定容至100 mL，精密吸取10 mL，加入40 mL無水乙醇混勻，4℃醇沉12 h，以轉速5 000 r/min離心5 min，沉淀用80%乙醇潤洗3次，60℃烘干得多糖粗樣品，用50 mL蒸餾水溶解，離心，取上清液按照苯酚硫酸法測定多糖含量[10]。

（2）胞外多糖分離、測定。過濾后所得發酵液中加入2 mg α-淀粉酶60℃酶解1 h，測定多糖含量。

1.2.7 萜類含量測定

（1）齊墩果酸標準曲線的繪制。齊墩果酸標準溶液：齊墩果酸標準品10 mg，以甲醇定容至50 mL。依次吸取標準溶液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8 mL于9支具塞磨口試管中，水浴加熱揮去溶劑，加入0.3 mL 5%香草醛冰醋酸溶液和1 mL高氯酸，密封。于70℃下水浴25 min，取出立即冰水冷卻，加入冰醋酸10 mL，搖勻，于550 nm處測定吸光度。以吸光值為縱坐標，以齊墩果酸標準溶液體積為橫坐標，繪制標準曲線。

（2）靈芝菌絲體總三萜含量的測定。靈芝菌絲體干品2.0 g，加入30 mL氯仿回流提取2 h，過濾后殘渣繼續回流提取，重復3次，合并濾液并定容至100 mL。精密移取1.0 mL于具塞磨口試管中，水浴加熱揮去溶劑，根據標準曲線計算三萜含量[10]。

1.2.8 總氮測定

凱氏定氮法[11]測定蛋白質含量。

1.2.9 多酚類成分測定

（1）樣品總多酚提取。干靈芝菌絲體1.0 g磨碎加入80 mL沸水，沸水浴浸提30 min，過濾、洗滌濾渣，將濾液合并、冷卻，加蒸餾水定容至100 mL。

（2）多酚含量測定。吸取1 mL樣品提取液加入4 mL蒸餾水和5 mL酒石酸亞鐵溶液，用pH值7.5磷酸鹽緩沖液稀釋至25 mL，混勻。以蒸餾水作空白對照，測定540 nm波長處吸光度，計算方法參照文獻[12]。

2 結果與分析

2.1 碳源對靈芝菌絲體生長量和胞外多糖含量的影響

碳源種類對菌絲體干質量和胞外多糖含量的影響見圖1。

圖1 碳源種類對菌絲體干質量和胞外多糖含量的影響

碳源種類對菌絲體生長以及胞外多糖的影響有一定差異。由圖1可知，葡萄糖為菌絲體生長最佳碳源，含量為4%時菌絲體干質量產量最多；可溶性淀粉為胞外多糖產量的最佳碳源，含量為4%時胞外多糖產量最多，但可能醇沉時含剩余淀粉；葡萄糖為碳源胞外多糖產量偏少，原因是菌絲體生長過多，發酵液過少。

2.2 氮源對靈芝菌絲體生長量和胞外多糖含量的影響

氮源種類對菌絲體干質量和胞外多糖含量的影響見圖2。

氮源種類對菌絲體生長和胞外多糖的影響有一定差異。由圖2可知，黃豆粉對菌絲體生長影響最大；黃豆粉和麥麩皮對胞外多糖的影響差異不大，硫酸銨對胞外多糖的影響出現異常的原因是菌絲體長得極少，未消耗的玉米粉被醇沉所致（經試驗驗證），確定黃豆粉為最佳氮源，其含量為2%時菌絲體干質量最多，1.5%時胞外多糖最多，原因可能是黃豆粉為2%時菌絲體量比1.5%時多，發酵液少導致胞外多糖量少。

2.3 無機鹽添加量對靈芝菌絲體生長量和胞外多糖含量的影響

添加一定濃度的無機鹽能夠促進菌絲生長。液態搖床發酵中，磷酸二氫鉀不同添加量的菌絲體生長和胞外多糖產量不同。

無機鹽添加量對靈芝菌絲體干質量和胞外多糖含量的影響見圖3。

圖2 氮源種類對菌絲體干質量和胞外多糖含量的影響

圖3 無機鹽添加量對靈芝菌絲體干質量和胞外多糖含量的影響

由圖3可知，隨著磷酸二氫鉀添加量增多，菌絲體生長量和胞外多糖產量都呈現先升高后降低的趨勢，確定磷酸二氫鉀添加量最適范圍為0.1%～0.2%。

2.4 響應面圖結果分析

根據Box-Benhnken中心組合試驗設計原理，選取黃豆粉、葡萄糖、可溶性淀粉、磷酸二氫鉀，采用四因素三水平響應面分析設計。

響應面試驗設計及數據處理見表2，菌絲體干質量數學回歸分析結果見表3，胞外多糖數學回歸分析結果見表4。

各因素經過回歸擬合，得到回歸方程：

表2 響應面試驗設計及數據處理

表3 菌絲體干質量數學回歸分析結果

表4 胞外多糖數學回歸分析結果

由表2可知，菌絲體干質量和胞外多糖回歸模型均具有顯著性（p＜0.05），失擬性具有不顯著性（p＞0.05），說明方程對試驗擬合較好。回歸方程各項方差分析表明，因素X1，X3，X22，X32對菌絲體干質量和胞外多糖有極其顯著性影響，因此，試驗因素對菌絲體干質量和胞外多糖影響不是簡單線性關系，二次項對其也有很大影響。

葡萄糖和可溶性淀粉添加量對菌絲體干質量響應面見圖4，磷酸二氫鉀和可溶性淀粉添加量對菌絲體干質量響應面見圖5，葡萄糖和磷酸二氫鉀添加量對菌絲體干質量響應面見圖6，葡萄糖和黃豆粉添加量對胞外多糖響應面見圖7，葡萄糖和可溶性淀粉添加量對胞外多糖響應面見圖8，葡萄糖和磷酸二氫鉀添加量對胞外多糖影響響應面見圖9。

運用Design Expert 8.0.6軟件對試驗結果統計分析，得到靈芝菌絲體生長和胞外多糖產量最優培養基配方為黃豆粉添加量1.63%，葡萄糖添加量2.33%，可溶性淀粉添加量3%，磷酸二氫鉀添加量0.1%，硫酸鎂添加量0.05%，VB1添加量50 mg/L。

2.5 胞內多糖、萜類、總氮和多酚含量測定結果

葡萄糖標準曲線回歸方程Y=0.683 5X-0.013 8，R2=0.997。測得靈芝菌絲體胞內多糖含量為15.37%，比文獻報道（10.13%）[13]高接近50%；齊墩果酸標準曲線回歸方程為Y=0.768 8X-0.025 3，R2=0.995。測得靈芝菌絲體萜類含量為1.36%，是文獻報道（0.33%）[13]的4倍；總氮含量為22.93%；多酚含量為1.91%，目前未見對靈芝菌絲體多酚含量測定的報道。

3 結論

（1）通過響應面試驗優化了靈芝培養基，確定靈芝菌絲體生長和胞外多糖產量的最優培養基配方為黃豆粉添加量1.63%，葡萄糖添加量2.33%，可溶性淀粉添加量3%，磷酸二氫鉀添加量0.1%，硫酸鎂添加量0.05%，VB1添加量50 mg/L；菌絲體干質量達1.94 g/100 mL，胞外多糖質量濃度為431 mg/100 mL；最優培養基經擴大培養得到的菌絲體干重和胞外多糖產量與響應面回歸方程得出的結果基本一致。

（2）最優培養基發酵獲得的菌絲體中活性成分胞內多糖和萜類含量很高，胞內多糖15.37%，總三萜1.36%，蛋白質22.93%，多酚1.91%。

圖4 葡萄糖和可溶性淀粉添加量對菌絲體干質量響應面

圖5 磷酸二氫鉀和可溶性淀粉添加量對菌絲體干質量響應面

圖6 葡萄糖和磷酸二氫鉀添加量對菌絲體干質量響應面

圖8 葡萄糖和可溶性淀粉添加量對胞外多糖響應面

圖9 葡萄糖和磷酸二氫鉀添加量對胞外多糖影響響應面

圖7 葡萄糖和黃豆粉添加量對胞外多糖響應面

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Optimization of Fermentation Medium by Response Surface Methodology and Active Component Analysis of Ganoderma lucidum

KONG Xianghui1，2，YANG Guoli3，GAO Yang4，*CHEN Xijun3，WANG Hui3，MA Yinpeng1，CHEN Dan3，CHEN He1，CHEN Jingyu1
（1.Institute of Microbiology，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin，Heilongjiang 150010，China；2.Institute of Advanced Technology，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin，Heilongjiang 150001，China；3.Heilongjiang Johnsun Biological Engineering Co.，Ltd.，Harbin，Heilongjiang 150028，China；4.Harbin University of Commerce，Harbin，Heilongjiang 150076，China）

The optimal culture medium formula of Ganoderma lucidum was studied in this paper based on dry weight of mycelium and extracellular polysaccharide content，and the active ingredients of mycelium and fermentation broth were also analyzed.The results showed that the optimal culture medium formula of Ganoderma lucidum contains 1.63%soybean powder，2.33%glucose， 3%soluble starch， 0.1%KH2PO4， 0.05%magnesium sulfate， 50 mg/L VB1.Under this formula， the mycelium had 15.37%intracellular polysaccharide， 1.36%terpene content， 22.93%protein content， 1.91%multi phenol content；and the fermentation broth contains 431 mg/100 mL extracellular polysaccharide.

Ganoderma lucidum；mycelium；intracellular polysaccharide；extracellular polysaccharide；active components

S567.31

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.12.010

1671-9646（2017） 12a-0034-05

2017-08-18

哈爾濱市應用技術研究與開發項目（2016RAXYJ046）。

孔祥輝（1971— ），女，博士，研究員，研究方向為食藥用菌深加工技術研究與產品開發。

*通訊作者：陳喜君（1969— ），男，博士，研究員，研究方向為菌物藥研發。