文冠果殼抗氧化活性及抑制人HepG2細胞增殖活性部位篩選△

張嚴磊，肖鴻飛，施歡賢，宋忠興，唐志書

(陜西中醫藥大學/陜西省中藥資源產業化協同創新中心，陜西省中藥基礎與新藥研究重點實驗室，陜西 咸陽 712083)

文冠果殼抗氧化活性及抑制人HepG2細胞增殖活性部位篩選△

張嚴磊*，肖鴻飛，施歡賢，宋忠興，唐志書

(陜西中醫藥大學/陜西省中藥資源產業化協同創新中心，陜西省中藥基礎與新藥研究重點實驗室，陜西 咸陽 712083)

目的篩選文冠果殼的抗氧化及抑制肝癌HepG2細胞增殖活性部位。方法用水，10%、30%、50%、70%、95%乙醇水溶液從文冠果中提取得到A、B、C、D、E和F提取物，用清除自由基DPPH·能力篩選抗氧化活性部位，用MTT法篩選抑制肝癌細胞增殖的活性部位。結果6個提取部位均有抗氧化活性和抑制HepG2細胞增殖作用，其中E(70%乙醇水提取)部位的抗氧化活性最強，當質量濃度為0.2 mg·mL-1時，其對DPPH·清除率能達到70.82%；提取部位F(95%乙醇水提取)抑制HepG2細胞增殖作用最強，當其質量濃度為75 μg·mL-1時，抑制率高達70.1%。結論文冠果殼提取物具有抗氧化及抑制人HepG2增殖活性，具有開發前景。

文冠果殼；抗氧化；抑制肝癌細胞；篩選

文冠果XanthocerassorbifoliaBunge 為無患子科(Sapindaceae)文冠果屬植物，單屬單種，是我國特有的珍稀木本油料植物，有“北方油茶”之稱，作為我國林業和科技部重力發展和扶持的農林作物，文冠果除作為油料樹種外，該植物還有良好的藥用、食用、觀賞等價值[1]。目前，許多研究已從文冠果殼中分離出三萜、黃酮、生物堿、單萜及脂肪酸等類化合物[2-3]。對于其生物活性據目前研究，文冠果殼具有抗炎、治療小兒遺尿、增強記憶、抗腫瘤等藥理作用[4-5]，但是對于其抗氧化活性及細胞活性的研究較少。本文基于實現資源的節約、循環、變廢為寶的原則，就其抗氧化及抑制人體HepG2細胞增殖的生物活性進行探索，從而為文冠果資源的綜合開發利用提供理論基礎與科學依據。

1 材料與試劑

1.1 材料

新鮮文冠果殼(楊凌普天農業科技有限公司)，通風處陰干、粉碎過4號篩，備用。

1.2 儀器與試劑

DMEM培養基(美國HyClone公司)；胎牛血清(浙江天航生物科技有限公司)；雙抗(北京索萊寶科技有限公司)；0.25%胰蛋白酶(美國HyClone公司)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)；抗壞血酸(Vc)(成都科龍化工試劑公司)；1，1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)標準品(Sigma公司)；1，10-鄰二氮菲(一水)(成都科龍化工試劑)；95%乙醇、無水乙醇、去離子水等試劑及溶劑均為分析純。

1.3 細胞株

人肝癌HepG2細胞株(中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心)。

2 方法

2.1 樣品制備

稱取適量文冠果殼細粉，按1∶4料液比分別與水，10%、30%、50%、70%、95%乙醇水溶液混勻水浴回流提取3次，每次2 h。過濾，去渣，將濾液濃縮得A、B、C、D、E和F 6個部位的浸膏。

2.2 抗氧化活性部位的篩選

2.2.1 樣品及Vc溶液的制備 分別稱取Vc及樣品A、B、C、D、E和F 6個部位各5 mg于25 mL量瓶中，甲醇定容，得母液。取適量母液用甲醇稀釋配制質量濃度梯度為0.01、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg·mL-1。

2.2.2 DPPH·溶液配制 精密稱取DPPH 12 mg于250 mL量瓶中，用甲醇定容，低溫避光保存、備用。

2.2.3 自由基DPPH·的清除試驗 取2 mL的DPPH·標準液加2 mL甲醇溶液充分混勻，常溫避光反應15 min，于517 nm處測量吸光度(A空白)，用各濃度樣品溶液代替甲醇測量其吸光度(A樣)，陽性對照參照樣品方法[6]。按公式(1)DPPH·清除率計算。

DPPH·清除率(%)=(A空白-A樣)/A空白×100%

(1)

式中：A空白—2 mL DPPH·溶液與2 mL甲醇的吸光度；A樣—2 mL DPPH·溶液與2 mL樣品溶液的吸光度。

2.3 抑制肝癌HepG2細胞增殖活性部位篩選

2.3.1 高糖DMEM培養基的配制 500 mL高糖DMEM培養基中加入胎牛血清、青霉素、鏈霉素，使其含10%胎牛血清，青霉素濃度為100 U·L-1，鏈霉素質量濃度為100 mg·mL-1。

2.3.2 HepG2細胞的培養 將HepG2細胞置于25 mL塑料培養瓶中，加入以上培養基，置于37 ℃含5% CO2的恒溫培養箱內。待細胞生長至90%融合時，用0.25%的胰酶消化傳代，3 d傳代1次。

2.3.3 MTT法檢測細胞相對存活率 將HepG2細胞以1×104個/每孔的密度接種于96孔板中，培養12 h使細胞充分貼壁。棄去培養基，分別加入不同濃度的文冠果殼的A、B、C、D、E和F提取部位。在細胞培養結束前4 h，每孔加入15 μL的MTT。培養結束后，吸去培養基，每孔加入150 μL的DMSO，37 ℃震蕩10 min，用多功能酶標儀檢測450 nm處的吸光度值(A)[7]。

3 結果分析

3.1 文冠果殼抗氧化活性部位的篩選

圖1 文冠果殼活性部位清除DPPH·自由基作用

由圖1可知，文冠果殼的A、B、C、D、E、F 6個不同溶劑提取部位對自由基DPPH·都顯示出了一定的清除效果，且有較好的量效關系，隨著提取物濃度的升高，對自由基DPPH·的清除效率也越高。其中，提取物E相比于A、B、C、D、F具有更好的清除活性，當提取物E的質量濃度為0.2 mg·mL-1時，其對自由基DPPH·的清除率高達70.82%。

3.2 文冠果殼不同提取部位抑制肝癌HepG2細胞增殖實驗

由圖2可知文冠果殼的A、B、C、D、E、F 6個不同溶劑提取物對HepG2細胞增殖均有一定的抑制作用，并且呈現出較好的量效關系，其中提取物E、F相比于A、B、C、D具有更好的生物活性。提取物F在低濃度時對HepG2細胞有促進生長和增殖作用，而當提取物質量濃度為75 μg·mL-1時對HepG2增殖的抑制率高達70.1%。

注：A.水提取物；B.10%乙醇提取物；C.30%乙醇提取物；D.50%乙醇提取物；E.70%乙醇提取物；F.95%乙醇提取物。圖2 文冠果殼活性部位對HepG2細胞增殖的影響

4 討論

本文文冠果殼不同質量濃度的乙醇提取物抗氧化活性和對HepG2癌細胞的細胞毒性實驗表明，70%乙醇提取物的清除自由基DPPH·效果最強，當其質量濃度為0.2 mg·mL-1時，其對DPPH·清除效率高達70.82%；95%提取物對癌細胞的細胞毒性作用最強，其質量濃度為75 μg·mL-1時，對人肝癌細胞HepG2增殖的抑制率高達70.1%。

文冠果在陜西、甘肅、遼寧、山西等地區已經有大規模的栽培，而且國家林業部在2015年底及2016年初分別在陜西省咸陽市及北京召開了文冠果產業發展助推大會，足見國家對該樹種的重視。目前，相關企業及研究機構對文冠果資源的開發以種仁榨油為主，而占果實總重超過50%的文冠果殼幾乎沒有被開發利用，被當作廢棄物丟棄。因此本研究內容及結果將對文冠果殼的資源化利用、文冠果資源的綜合開發及提高文冠果產業的經濟附加值具有一定的指導意義。

[1] 尚宏芹.文冠果提取物藥理作用研究進展[J].動物醫學進展，2010，31(6)：103-106.

[2] 王穎，姜生，孟大利，等.文冠果的化學成分與生物活性研究進展[J].現代藥物與臨床，2011，26(4)：269-273.

[3] 毛迪銳，姜貴全，張卓睿，等.文冠果殼總皂苷超聲波輔助提取工藝優化[J].食品與機械，2014，30(2)：170-174.

[4] Ma Chaomei，Nakamura N，Hattori M，et al.Inhibitory effects on HIV-1 protease of constituents from the wood of Xanthoceras sorbi-folia[J].J Nat Prod，2000，63(2)：238-242.

[5] 劉新霞，楊新愛，屈嬋，等.文冠果果殼提取物對學習記憶障礙的改善作用[J].中藥新藥與臨床藥理，2007，18(1)：23-25.

[6] 卜令娜，張佳，徐月敏，等.油橄欖葉清除自由基活性部位篩選[J].食品工業，2013，34(6)：131-134.

[7] 唐淵，李曉輝.莪術提取物對肝癌細胞系HepG2的抗癌作用及機制研究[J].中國藥理學通報，2007，23(6)：790-794.

AntioxidantActivityofFruitShellsofXanthocerassorbifoliaandScreeningofActiveComponentsInhibitingProliferationofHepG2CellLines

ZHANGYanlei*，XIAOHongfei，SHIHuanxian，SONGZhongxing，TANGZhishu

(ShaanxiUniversityofChineseMedicine/ShaanxiCollaborativeInnovationCenterofIndustrializationofTraditionalChineseMedicineResources；ShaanxiKeyLaboratoryofNewDrugsandBioactiveConstituentsofTraditionalChineseMedicine；Xianyang712083，China)

Objective：To screen the activity part of the antioxidant and inhibiting the proliferation of HepG2 cell line from the fruit shells of Xanthoceras sorbifolia.MethodsThe fruit shells ofX.sorbifoliawere extracted by water，10%，30%，50%，70% and 95% ethanol aqueous，respectively，and obtained six different parts named as A，B，C，D，E and F.These fractions were assayed by scavenging the DPPH· free-radical to determine their antioxidant activity and inhibiting the proliferation against HepG2cell line by MTT method.ResultsAll the extracts of the fruit shells ofX.sorbifoliashowed the antioxidant activity and inhibiting the proliferation of HepG2cells.Among them，part D(the extract of 70% ethanol aqueous)showed the strongest activity for scavenging the DPPH free-radical，and when its concentration was 0.2 mg·mL-1，the capacity of antioxidant activity could go up to 70.82%.While the part E possessed the best anti-proliferation activity against HepG2cells，and its inhibition reached 70.10%.ConclusionIn this paper we studied the anti-proliferation activity against HepG2cells and antioxidant activity of different solvent extract from the fruit shells ofX.sorbifolia，and provided the theory basis for potential use of the fruit shells ofX.sorbifolia.

Shells of Xanthoceras sorbifolia ;antioxidant; Inhibiting proliferation;screen

陜西省協同創新計劃項目(2015xt-52)；陜西省科技統籌創新工程計劃項目(2016KTTSSF01-06-01)

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張嚴磊，博士，講師，研究方向:中藥資源產業化研究與開發；E-mail：nwuzyl@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.11.015

2017-03-01)