響應面法優化蒼耳子中綠原酸的提取工藝

羅婷，周坤，葉宏俊，李鴻杰，付永莉，文婷

(華中科技大學同濟醫學院附屬精神衛生中心，湖北 武漢 430022)

響應面法優化蒼耳子中綠原酸的提取工藝

羅婷，周坤*，葉宏俊*，李鴻杰，付永莉，文婷

(華中科技大學同濟醫學院附屬精神衛生中心，湖北 武漢 430022)

目的優化蒼耳子中綠原酸的提取工藝。方法采用Box-Benhnken中心組合設計，以綠原酸得率為評價指標，對提取溫度、液料比和提取時間3個影響因素進行考察，以Design-Expert 8.05軟件對實驗數據作統計處理。結果Box-Benhnken優化蒼耳子中綠原酸最佳提取工藝條件為提取溫度89 ℃、9倍量50%乙醇、提取時間2 h，此工藝條件下綠原酸平均提取率可達1.94%。結論利用Box-Behnken響應面法優選的提取工藝穩定可行，對蒼耳子中綠原酸提取有較好的理論指導價值。

蒼耳子；響應面法；綠原酸；提取工藝；高效液相

蒼耳子系菊科植物蒼耳XanthiumsibiricumPatr.的干燥成熟帶總苞的果實，有散風寒、通鼻竅和祛風濕等功能[1]。其主要含多酚類、揮發油、倍半萜內酯、水溶性苷、脂肪酸等[2]多種化學成分。現代藥理研究表明，蒼耳子具有殺蟲、抗菌、抗病毒、消炎、鎮痛、抑制癌細胞增殖、增強免疫等多種藥理活性[3]，而上述藥理活性的發揮與其所含有的酚酸類成分綠原酸是密不可分的[4]。有研究[5]報道，炮制溫度對綠原酸的含量存在較大影響，故溫度為影響綠原酸含量的一大因素。目前，對蒼耳子的研究主要集中于其化學成分、藥理作用及臨床應用方面，有關其提取工藝的研究報道相對較少[6]。為更加科學、合理和充分利用蒼耳子這一中藥資源，本研究以蒼耳子為對象，采用高效液相色譜法測定綠原酸含量，并以其得率為響應值，結合響應面法優化蒼耳子中綠原酸的提取工藝，考察提取時間、提取溫度和液料比等因素之間交互作用對綠原酸提取率的影響，為蒼耳子提取工藝的優化及深入開發與應用提供基礎數據和理論參考。

1 儀器與試藥

DIONEX-Ultimate 3000高效液相色譜儀；Starsorius BSI型電子分析天平；KQ-250E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；RE-52AA旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；HH-4數顯恒溫水浴鍋(江蘇省榮華儀器制造有限公司)。

蒼耳子藥材(湖北天濟中藥飲片有限公司)，經湖北中醫藥大學生藥教研室鑒定為菊科植物蒼耳XanthiumsibiricumPatr.et Widd.的成熟帶總苞的果實；綠原酸(中國食品藥品檢定研究院，批號：110753-2015)；甲醇為色譜純(美國天地公司)；其他試劑均為分析純；水為三蒸水。

2 方法與結果

2.1 綠原酸含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相0.5%磷酸(A)-甲醇(B)；流速0.8 mL·min-1；柱溫25 ℃；檢測波長327 nm；進樣量10 μL。理論塔板數按綠原酸色譜峰計應不低于3600，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.1.2 對照品溶液的制備 取綠原酸對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解制成質量濃度為0.02 mg·mL-1的溶液，搖勻即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 取蒼耳子藥材粗粉100 g，精密稱定，加50%乙醇回流提取(液料比、提取時間和溫度參照表4 Box-Behnken 實驗方案的因素和水平)，過濾，濾液減壓濃縮，回收溶劑，于烘箱中40 ℃干燥，即得蒼耳子浸膏粉。取浸膏粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加50%甲醇25 mL，搖勻、密塞稱定其重量。超聲處理30 min，冷卻至室溫再稱定重量，以甲醇補足減失的量，濾過，取續濾液5 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，以0.45 μm微孔濾膜濾過。

2.1.4 系統適用性試驗 分別取上述供試品溶液、對照品溶液、空白溶劑各進樣10 μL，按照2.1.1項下色譜條件進行分析，分析結果見圖1～3。從圖中可以看出，在該條件下綠原酸與相鄰的峰基線分離度良好，其分離度大于1.5，且樣品中其他組分無干擾。

圖1 供試品的HPLC圖譜

圖2 綠原酸對照品的HPLC圖譜

圖3 空白溶液HPLC圖譜

2.1.5 線性關系考察 分別精密吸取綠原酸對照品溶液2、4、8、10、12 μL，注入高效液相色譜儀，按2.1.1項下色譜條件測定。以對照品進樣質量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：Y=45.325 3X-0.007 4，r=0.999 9。結果表明，綠原酸在0.04～0.24 μg呈良好的線性關系。

2.1.6 方法學考察 精密度試驗：精密吸取綠原酸對照品溶液10 μL，連續重復進樣6次，按2.1.1項下色譜條件測定，經計算得RSD為0.67%。結果表明，儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液，照2.1.1項色譜條件，分別于0、3、6、9、12、24 h精密吸取10 μL，注入液相色譜儀測定，經計算得RSD為1.25%。結果表明，供試品溶液在24 h內穩定。

重復性試驗：取同一批次蒼耳子藥材，按2.1.3項下供試品溶液的制備方法，依法平行制備供試品溶液6份，按2.1.1項下色譜條件進行測定。對結果進行統計，經計算得綠原酸含量的RSD為0.95%，結果表明，該方法的重復性良好。

2.1.7 加樣回收試驗 各取6份已知含量的蒼耳子浸膏粉適量，精密稱定，每份約0.5 g。向各樣品中分別準確加入近等量的綠原酸對照品混勻，按2.1.1項下色譜條件進行測定。對結果進行統計，計算加樣回收率，結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果(n=6)

2.2 提取工藝優選

2.2.1 試驗設計 在單因素考察基礎上選取提取溫度、液料比、提取時間和提取次數4個影響因素作為自變量，鑒于其中提取次數為非連續型變量，可不考慮回歸分析，結合工業生產實際情況及文獻[7]，擬設定為2次。根據Box-Behnken設計原理，取提取溫度、液料比、提取時間每個因素下各設定3個水平，依次用代碼值-1、0、+1表示。Box-Behnken設計中心組合設計因素水平見表3，以蒼耳子提取物中綠原酸的得率為評價指標，Box-Behnken 試驗方案與結果見表4。

2.2.2 模型擬合與方差分析 運用 Design-Expert軟件對表4中的數據作回歸分析，得液料比(A)、提取溫度(B)、提取時間(C)與綠原酸得率(Y)之間的線性回歸擬合方程：Y=-19.195+1.137 5A+0.405 0B+0.46C+0.012 5AB+0.03AC-0.05BC-0.17A2-0.002 85B2-0.06C2(決定系數R2=0.988 1)。方差分析結果表明，擬合得到的回歸方程P<0.01，說明該模型在本研究所選定的因素范圍內有統計學意義。A、B、AB、A2、B25個因素對綠原酸得率的線性效應有極顯著影響(P<0.01)；因素C2對綠原酸得率的線性效應有顯著影響(P<0.05)；因素A、B交互作用對綠原酸得率的線性效應有極顯著影響(P<0.05)，響應面模型方差分析結果見表5。

表3 Box-Behnken設計中心組合設計因素水平

表4 Box-Behnken試驗方案與結果

表5 響應面模型方差分析結果

注：P<0.01 為極顯著；P<0.05為顯著。

本模型擬合極顯著(P<0.01)、失擬項P值(0.872 1)大于0.05說明，實驗誤差小且實測值與預測值之間不存在失擬，因而該數學模型具有較好的預測性，故可以采用該模型對其作響應面分析。Design-Expert軟件繪制液料比、提取溫度和提取時間因素對于響應值的三維曲面見圖4～6、響應值的等高線見圖7～9。

圖4 液料比、提取時間交互作用對于響應值的三維曲面圖

圖5 液料比、提取溫度交互作用對于響應值的三維曲面圖

圖6 提取溫度、提取時間交互作用對于響應值的三維曲面圖

圖7 液料比、提取時間交互作用對于響應值的等高線圖

圖8 提取溫度、提取時間交互作用對于響應值的等高線圖

圖9 液料比、提取溫度交互作用對于響應值的等高線圖

比較3組曲面響應圖可知，液料比(A)與提取溫度(B)的響應曲面圖呈現較陡峭的曲面，故此二者的交互作用對綠原酸提取率的影響最為顯著。其他兩個交互作用對綠原酸提取率的影響較小；響應曲面均為開口向下的凸面，等高線為橢圓形，響應值中心位于考察區域范圍內，可知在所考察的范圍內存在綠原酸得率最大值；響應面為高度卷曲的曲面，說明響應因素與相應值之間的關系不是簡單的一次線性方程所能解釋的。由Design-Expert軟件統計分析數據，給出蒼耳子中提取綠原酸的參考工藝：液料比為8.6倍、提取溫度為88.68 ℃、提取時間為2 h，理論計算最優綠原酸得率可達1.942%。為方便提取實際操作，將此工藝條件進一步調整：液料比9倍、提取溫度為89 ℃、提取時間為2 h進行驗證試驗。

2.2.3 驗證試驗 準確稱取蒼耳子細粉3份，每份100 g，按優選的工藝條件進行綠原酸提取，結果見表6。

表6 驗證試驗結果 %

試驗結果與回歸方程的預測值較接近，驗證了該數學模型的準確性，故采用其優化蒼耳子中綠原酸提取工藝是有指導意義的。

3 討論

目前，綠原酸的提取工藝研究中多采用正交設計，正交試驗是對孤立的實驗點進行分析的一種優化多變量系統的有效試驗設計工具，能給出最佳因素水平組合，卻無法找出整個區域上因素最佳組合和響應值的最優值[8]。而響應面法則通過對響應面等值線的分析尋求最優工藝參數，將多因素試驗中因素與指標的相互關系用二次多項式擬合的一種統計方法；研究因素與響應值之間、因素之間的交互作用，獲得的預測模型多為曲面，在實驗條件尋優過程中，可以連續地對實驗各水平進行分析[9]；能快速、有效地從影響綠原酸得率因素中篩選出最顯著的因素，避免次要因素帶來的資源和時間浪費，同時以較少實驗次數和較短時間對所選的實驗參數進行全面考察[10]。

本研究采用效應面法優化蒼耳子提取工藝，對液料比、提取溫度和提取時間等因素及其交互作用進行考察。結果發現，液料比、提取溫度對蒼耳子中綠原酸的提取有極顯著性影響；影響次序為液料比>提取溫度>提取時間，而提取時間對綠原酸得率的影響不顯著(p<0.001)；液料比和提取溫度的交互作用對綠原酸得率有顯著影響。在規?；崛∵^程中從溶劑消耗、生產效率和降低成本等角度考慮，提取次數定為2次完全滿足生產需要，充分結合本研究所優化的工藝參數，確定蒼耳子最優工藝條件為提取溫度89 ℃、9倍量50%乙醇、提取時間2 h、提取2次，為蒼耳子中綠原酸提取提供了參考和依據。

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ExtractionofChlorogenicacidinFructusXanthiibyResponseSurfaceMethod

LUOTing，ZHOUKun*，YEHongjun*，LIHongjie，FUYongli，WENTing

(AffiliatedMentalHealthCenter,tongjiMedicialofHuazhonguniversityofscience&Technology，HubeiWuhan，430022，China)

Objective：To optimize extraction of chlorogenic acid in Fructus Xanthii.MethodsWith the content of chlorogenic acid yield in Fructus Xanthii as an index，the effect of three factors，i.e.extraction temperature，solvent-solid ratio and extraction time was designed by Box-Behnken central composite.Design-Expert 8.05 software was used for the statistical processing of the experimental data.ResultsThe optimizing extraction conditions of Fructus Xanthii were as follows：ethanol concentration was 50%，extracting time was two hours extracting temperature was 79 ℃ and solvent-solid ratio was 9.Under the conditions，the average chlorogenic acid yield was 1.94%.ConclusionThe optimized extraction of chlorogenic acid in Fructus Xanthii by application of response surface methodology is stable and feasible and the result can provide theoretical guidance for large-scale extraction chlorogenic acid in Fructus Xanthii.

Fructus Xanthii；response surface methodology；chlorogenic acid；extraction；HPLC

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周坤，藥師，研究方向：制劑研究，E-mail：822733781@qq.com；葉宏俊，藥師，研究方向：制劑研究，E-mail：822733781@qq.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.11.025

2017-01-18)