基于系統藥理學探索痛瀉要方治療腸易激綜合征的分子機制△

繆樂濤，張婧嫻，芮俊乾，陳逸凡，楊星昊

(南京師范大學 生命科學學院，新藥研究中心，江蘇 南京 210023)

基于系統藥理學探索痛瀉要方治療腸易激綜合征的分子機制△

繆樂濤，張婧嫻，芮俊乾，陳逸凡，楊星昊*

(南京師范大學 生命科學學院，新藥研究中心，江蘇 南京 210023)

目的建立痛瀉要方治療腸易激綜合征(IBS)的“化合物-靶點-通路”的網絡，研究其多成分、多靶點、多途徑的作用機制。方法利用TCMSP數據庫為基礎查找痛瀉要方的化學成分，利用Drug Bank數據庫檢索作用靶點，構建藥物-成分-靶點數據庫；在PubMed Gene數據庫中檢索疾病相關基因，通過 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)數據庫對獲取的靶點進行相關通路分析，利用Cytoscape軟件構建痛泄要方的“化合物-靶點-通路-疾病”網絡圖。結果獲得痛瀉要方中有效成分42種，相關作用靶點18個，涉及35條信號通路。結論痛瀉要方可能通過作用于免疫、炎癥、內分泌系統的相關蛋白靶點及通路，起到治療IBS的作用。

痛瀉要方；腸易激綜合征；系統藥理學；作用機制

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)為消化道常見的一種功能性疾病，其主要癥狀為腹部不適和(或)疼痛及慢性間隙性排便習慣和大便性狀的改變，有時伴隨機體其他各個系統的變化。歐美國家患病率約為10%～15%，大部分亞洲國家的IBS流行率在0.8%～10%[1]。隨著經濟發展，人們的生活節奏加快，我國該類疾病發病率日益上升。腸易激綜合征發病機制至今尚未完全闡明，目前認為主要與腸道動力異常、內臟感覺異常、神經-免疫-內分泌異常并與精神、心理因素等相關，被公認為臨床常見的難治疾病。

痛瀉要方始載于《景岳全書》，原方由白術、白芍、陳皮和防風組成，有補脾瀉肝之功用。據統計分析，痛泄要方是臨床最常用的基礎方，多數臨床有效方均從痛泄要方衍變而來，經痛瀉要方治療后腹瀉型IBS患者的各癥狀積分、癥狀總積分(腹痛或腹部不適、大便次數、大便性狀異常、黏液便)顯著改善，臨床治療腸易激綜合征具有安全有效的優勢[2]。實驗研究表明，痛瀉要方能調節體內外腸肌運動紊亂、促進小腸吸收功能、降低內臟高敏感大鼠腸道敏感性、抑制應激腹瀉大鼠排便次數、減少糞便含水量、降低結腸動力[3]；對小鼠小腸推進功能亢進模型及小腸推進功能抑制模型具有雙向調節作用[4]。進一步研究發現，痛瀉要方降低模型大鼠腦內和腸道組織中5-羥色胺(5-HT)水平、調節5-HT受體表達，減弱背角神經元興奮性，從而提高內臟痛閾、消除腸道高敏感[5]。對P物質(SP)、降鈣素基因相關肽、血管活性腸肽、胰高血糖素樣肽、生長抑素等胃腸激素具有顯著調節作用[6]。我們課題組前期從痛泄要方乙醇提取物中鑒定23種不同類型成分，重點研究痛泄要方血腦成分譜中11種藥代標記物的大鼠血液、腦組織、尿液中代謝趨勢，初步闡明痛泄要方中一些重要化學成分在大鼠體內吸收、代謝、轉化的規律[7-8]。以上研究表明，痛瀉要方具有多成分、多靶點、多途徑的特點。雖然目前對痛瀉要方的研究逐年深入，但針對痛泄要方治療IBS的作用機制研究仍不夠系統和全面。

近年來，系統藥理學的概念隨著計算機技術、基因組學、蛋白質組學、代謝組學、生物信息學等理論的發展應運而生。系統藥理學是從分子、網絡、細胞到組織、器官、個體乃至群體等不同層次的系統水平研究藥物與機體相互作用及其規律、作用機制的一門新興學科，研究藥物治療疾病時引起機體功能變化的機制，建立藥物對機體作用的相互作用網絡，并通過網絡分析，系統地闡述藥物多分子對疾病的協同作用[9]。中藥復方是多組分、多靶點及其組分間協同作用的復雜體系，使得中藥的深入研究呈現巨大困難。系統藥理學提供了從整體水平研究中藥復方的思路和方法，在中藥活性組分篩選、系統靶標發現、中藥配伍理論研究、作用機制闡明等方面已顯示了良好的應用前景[10]。

本文嘗試應用系統藥理學的方法對痛瀉要方治療IBS的作用機制進行探索，構建其“藥物-化合物-靶點”的網絡藥理圖，獲得相關通路并對其進行分析，為后續實驗研究提供理論依據。

1 材料

TCMSP數據庫，Drug bank數據庫，NIH 基因數據庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)，Cytoscape2.6.0軟件，DAVID分析工具，UniProt KB數據庫，京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路數據庫。

2 方法

實驗研究思路示意圖見圖1。

圖1 痛瀉要方治療IBS作用機制的系統藥理學研究思路

2.1 腸易激綜合征相關基因的檢索

以腸易激綜合征(irritable bowel syndrome)為關鍵詞，從美國國家衛生研究所(national institutes of health，NIH)基因數據庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov /gene)中查找腸易激綜合征的相關基因(檢索日期為2016年10月8日)。

2.2 痛瀉要方中藥材的化學成分及對應靶點的檢索

以白術、防風、白芍、陳皮為檢索詞，從TCMSP數據庫(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform)中檢索相應化學成分[11]，并導入Drug Bank數據庫獲得相應作用靶點，并通過UniProt KB數據庫核對，所獲得的作用靶點包括這些天然化學成分直接作用或間接影響的蛋白分子。

TCMSP是中藥藥物研究平臺及數據庫，囊括了2015年版《中華人民共和國藥典》收錄的全部中藥材的組分數據，包括13 144個分子及29 384個化合物，涵蓋了每個化合物的吸收、分布、代謝、排泄、毒性參數及類藥性參數。

DrugBank數據庫是世界上最主流的藥物數據庫之一，包括已知的3000多種藥物的化學、藥理學、醫學以及分子生物學信息，還包括4100種已經獲準或正在實驗中的藥物產品。

2.3 相關通路的注釋分析

將檢索獲得的基因及蛋白導入DAVID聚集化分析工具中，設置參數，Select Identifier：OFFICIAL-GENE-SYMBOL；List Type：Gene List。進行富集化分析和 KEGG 通路注釋分析，靶點富集的通路被認為是藥物調控的通路。

DAVID(the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery)是一個生物信息數據庫網址(http：//david.abcc.ncifcrf.gov/)，它整合了生物學數據和分析工具，為大規模的基因或蛋白列表(成百上千個基因ID或者蛋白ID列表)提供系統綜合的生物功能注釋信息，幫助用戶從中提取生物學信息[12]。

2.4 痛瀉要方“有效成分-靶點”以及“基因-通路”網絡構建

以藥物的有效成分以及作用于IBS的預測靶點為節點(node)，分別在Excel表格中構建彼此相應的關系，導入Cytoscape2.6.0軟件，用Network Analyzer插件構建“有效成分-靶點”以及“基因-通路”的網絡圖。若其中某一靶點為某一化合物的潛在作用靶點，則二者以邊(edge)連接。若通路中有參與調節的靶點，則把通路與靶點以邊(edge)連接，以此構建“有效成分-靶點”以及“基因-通路”網絡圖。

3 結果

3.1 與IBS相關的基因

截止2016年10月8日，在基因數據庫中總共獲得67種與IBS相關的基因以及與之相對應的人源蛋白。

3.2 所含化合物及其靶點的收集與處理

通過TCMSP數據庫從痛瀉要方中檢索到376個小分子化合物。其中白芍85個、防風173個、白術55個、陳皮63個，導入Drug bank數據庫，可獲得990、1931、773、479相關靶蛋白。去除一些重復的成分及靶點，初步構建351種化學成分，3977個靶蛋白數據庫。在獲得的藥物-成分-靶點的數據庫中進行篩選，發現共有18個與IBS治療相關的靶點，見表1。在數據庫中對這18個靶點起作用的有效成分共有42種，見表2。

表1 痛瀉要方調控IBS的靶點

表2 痛瀉要方調節相關靶點的有效成分

表2(續)

對篩選獲得的靶點分析發現，IL-10、IL-1B、IL-4、IL-6、TNF與體內炎癥免疫反應相關；SLC6A4、HTR3A、HTR2A、CRF等與內分泌調節相關；BDNF與神經細胞生長調節相關。

對中藥有效成分分析發現，這些成分包括黃酮類(柚皮苷Naringin、山柰酚Kaempherol、漢黃芩素Wogonin、川陳皮素Nobiletin)、萜類(芍藥苷Paeoniflorin)、內酯類(白術內酯I Atractylenolide-1、白術內酯III Atractylenolide-3)、香豆素類(秦皮素fraxetin、補骨脂素Psoralen、紫花前胡苷Nodakenin、蛇床子素osthol)、酚類(香蘭素Vanillin)、草烯alpha-humulene、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、胡蘿卜苷beta-sitosterol、揮發性成分[萜品醇Terpineol、蒼術酮(5E，9Z)-3，6，10-trimethyl-4，7，8，11-tetrahydrocyclodeca[b]furan]和脂肪酸類(十八烯酸Oleic acid)等。

3.3 痛瀉要方潛在靶點的通路注釋及分析

將預測出的靶點通過DAVID 6.9工具及KEGG數據庫進行通路分析，共找到35條與IBS相關的通路，見表3。這35條通路中，其中與炎癥免疫相關的通路共有30條；與內分泌神經系統相關的通路共有5條。

3.4 “有效成分-靶點”以及“基因-通路”網絡結果

運用Cytoscape2.6.0軟件構建“有效成分-靶點”以及“基因-通路”網絡結果，見圖2、3。

4 討論

通過對痛泄要方“化合物-靶點-通路”前文網絡進行分析發現，痛瀉要方中調控IBS基因的42種有效成分主要包括黃酮類、香豆素類、萜類、色原酮類、揮發性成分(烯類、醇類、芳香酚類、有機酸類、醛類)，這些成分既有共同的作用靶點群及通路群，又各有偏重，各通路群間通過共有靶點連接，顯示出不同成分間的多靶點協同作用。體現出復方多成分、多靶點、多通路整合調節的作用特點。

使用MAS3.0軟件對作用靶點進行GO分析，獲得靶點的具體功能，見表4。GO分析從分子功能、生物過程以及細胞組分三方面對調控靶點進行分析。這里以P值為參數，選擇排名前五的功能進行討論?？梢院苊黠@地看出，分子功能中以細胞因子5-羥色胺受體激素作用為主，而生物過程中則以炎癥應答為主。這說明痛瀉要方主要通過對5-羥色胺受體等激素以及體內炎癥應答反應的調控，從而治療腸易激綜合征。

圖2 藥物-成分-靶點

圖3 痛瀉要方調控IBS的信號通路

表4 靶點的GO分析

另外，網絡分析顯示，有關靶點所涉及的通路大致可以分為兩類，痛瀉要方可能通過對這兩類通路的調節發揮其治療作用。

第一類免疫和炎癥相關信號通路，以T細胞受體信號通路(T cell receptor signaling pathway)、Toll樣受體信號通路(TLRs，Toll-like Receptors Pathway)、腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)、絲裂原活化蛋白激酶信號通路(MAPK signaling pathway)等為代表，主要由c-FOS、白細胞介素(IL)、腫瘤壞死因子(TNF)、基質金屬蛋白酶(MMP9)等分子參與調節。近年來，臨床發現，IBS病人不同程度存在腸道低度炎癥、免疫激活、黏膜屏障功能降低。實驗研究發現，IBS病人免疫細胞(腸道肥大細胞)及細胞因子(IL-1)異常。Halvorson等[13]通過Meta分析認為感染性胃腸炎患者是正常人群患IBS概率的7倍，其機制可能與病原微生物侵入腸道后導致炎癥細胞趨化及免疫細胞的激活，并釋放多種介質如TNF、IL、組胺、類胰蛋白酶等，破壞腸黏膜屏障，增加了腸黏膜的通透性，最終導致IBS的發生。從網絡分析結果來看，黃酮類(柚皮苷、山柰酚、漢黃芩素、川陳皮素)、萜類(芍藥苷)、內酯類(白術內酯I、白術內酯III)、香豆素(秦皮素)、酚類(香蘭素)、草烯能夠與白細胞介素-2、TNF、MMP9等蛋白作用，通過調節多條炎癥相關通路來降低體內炎性因子的含量，發揮其抗炎作用。據文獻報道，白術內酯Ⅰ可作用于TLR4，對小鼠腹腔巨噬細胞有抑制作用，并通過抑制NF-κB p65的核轉位，而抑制TNF-α和NO產生，發揮抗炎作用[14]。草烯通過對NO以及IL-1等細胞因子的調控具備抗潰瘍以及抗炎功效[15]。Qian等發現[16]，芍藥總苷通過阻斷Toll樣受體4/5信號通路，抑制樹突狀細胞的功能，從而減輕了免疫介導的炎癥反應，這些實驗結果與本文預測結果相一致。

第二類神經和內分泌系統相關通路，包括絲裂原活化蛋白激酶信號通路(MAPK signaling pathway)、Hepatitis B、Non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD)、Inflammatory mediator regulation of TRP channels、Serotonergic synapse。其中，腦源性神經營養因子(BNDF)能夠調控神經細胞的生長、生存、分化和凋亡，保護由于應激引起的神經元損傷，維持神經系統的正常功能。脂肪細胞因子(ADIPOQ)是脂肪細胞特異性分泌的一種細胞因子，能夠調控生物體的能量穩態、葡萄糖代謝和脂肪代謝，參與調節肝臟腸道功能。促腎上腺皮質激素釋放因子(CRF)與特異性受體結合可調節結腸運動、結腸擴張及內臟疼痛敏感性，辣椒素受體(TRPV1)是分布于傷害性感覺神經元的非選擇性陽離子通道，在胃腸道的感覺神經纖維及相應背根神經節上有廣泛表達，并參與內臟高敏感性及胃腸動力的改變，與多種功能性或器質性疾病(如功能性消化不良、腸易激綜合征、消化性潰瘍、炎癥性腸病等)存在密切聯系[17]。5-羥色胺受體(HTR2A，HTR3A)、5-羥色胺轉運體(SLC6A4)是5-HT信號通路的主要構成元件。在5-HT的合成、釋放、與受體結合及重攝取等的信號轉導過程中，任一環節發生異常均有可能導致胃腸道動力、分泌功能改變和內臟高敏感的產生[18]。從網絡分析結果來看，黃酮類(柚皮素)、內酯類(白術內酯I、白術內酯III、香豆素類(補骨脂素、紫花前胡苷、蛇床子素)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、胡蘿卜苷、揮發性成分(萜品醇、蒼術酮)和脂肪酸(十八烯酸)能夠與CRH、轉化生長因子β1、腦源性神經營養因子、脂肪細胞因子、SLC6A4、HTR2A，HTR3A等蛋白分子作用，通過調節神經或內分泌系統相關通路來影響內臟感覺傳遞和胃腸功能。內臟高敏感和胃腸功能紊亂是IBS的主要致病機制。文獻報道，痛瀉要方能夠降低結腸局部的5-HT、SP含量，并減弱背角神經元興奮性，提高內臟痛閾、消除腸道過敏[19]。白術內酯增強唾液淀粉酶活性，促進腸管吸收，調節腸道功能[20]。本課題組前期的研究表明，痛瀉要方中有效成分對IBS模型大鼠 5-HT信號通路的多個關鍵環節的蛋白水平和mRNA水平都有顯著的調節糾偏作用(結果即將發表)。這些實驗結果驗證了本研究的預測結果。

本研究結果顯示，痛泄要方中黃酮類、香豆素類、萜類等有效成分通過作用于c-FOS、IL、TNF、MMP9、CRH、轉化生長因子β1、腦源性神經營養因子、脂肪細胞因子、SLC6A4、HTR2A、HTR3A等多個靶點，從而調控機體免疫、內分泌及神經系統的相關通路發揮治療作用。本研究初步揭示了痛泄要方治療腸易激綜合征的多維調控網絡，為深入研究痛泄要方的作用機制提供了思路。

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NetworkPharmacology-basedStudyonMechanismofTONGXIEYAOFANGinTreatmentofIrritableBowelSyndrome

MIAOLetao，ZHANGJingxian，RUIJunqian，CHENYifan，YANGXinghao*

(CollegeofLifeSciences,NanjingNormalUniversity，Nanjing210023，China)

Objective：To establish the network of “compound-target-pathway” in the treatment of irritable bowel syndrome(IBS)in Tongxieyaofang，and study its multi-component，multi-target and multi-path mechanism.MethodsThe drug-constituent-target database was constructed by using the Drug Bank database，and the disease-related genes were searched in the PubMed Gene database.The genes of the disease-related genes were searched by the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG database was used to analyze the acquired pathways，and Cytoscape software was used to construct the “compound-target-pathway-disease” network.ResultsThere were 42 effective components in pain-relieving recipe and 18 related-related targets，involving 35 signal pathways.ConclusionTongxieyaofang may play a role in the treatment of IBS through the role of immune，inflammation，endocrine system related protein targets and pathways.

TONGXIEYAOFANG；irritable bowel syndrome；network pharmacology；molecular mechanism

江蘇省高校自然科學研究重大項目(15KJA360001)

*

楊星昊，博士，教授，研究方向：E-mail：yangxinh@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.11.012

2017-04-10)