不同清創法對開放性創口早期感染敏感指標影響的實驗研究

盧 冰，趙嬋娟，鐘振東

(1.四川省醫學科學院·四川省人民醫院骨科，四川 成都 610072；2.四川大學華西第二醫院，四川 成都 610041)

不同清創法對開放性創口早期感染敏感指標影響的實驗研究

盧 冰1，趙嬋娟2，鐘振東1

(1.四川省醫學科學院·四川省人民醫院骨科，四川 成都 610072；2.四川大學華西第二醫院，四川 成都 610041)

目的探討不同清創法對開放性創口早期感染敏感指標的影響。方法將96只SD大鼠隨機分為8組，除正常組外，各組用無菌手術法切除皮膚，去掉皮下組織和部分肌肉，造成基底凹凸不平的創面，將大腸桿菌懸濁液(細菌數>1×109個/ml) 1 ml 均勻涂于各傷口表面，使局部細菌數>1×107個。對照組傷口不予沖洗，其余各組分別用肥皂水和生理鹽水處理。分別采集1、3、7d的標本檢測，通過ELISA、QRT-PCR和Western blot技術，觀察感染的發生、發展、預后與免疫因子血清降鈣素原(PCT)、腫瘤壞死因子(TNF)-α和脂聯素(APN)之間的動態變化，比較各組對開放性創口早期感染敏感指標的影響。結果與正常組比較，對照組PCT、TNF-α水平同時升高，APN水平降低。各高低壓處理組均能不同程度降低PCT、TNF-α水平，升高APN水平(P< 0.01)，且高壓肥皂水沖洗組和高壓生理鹽水沖洗組術后切口早期感染發生率低于低壓肥皂水和低壓生理鹽水組(P< 0.05)。傳統沖洗方式組作用7d后PCT、TNF-α和APN的水平差異無統計學意義(P> 0.05)。結論對于開放性創口早期感染敏感指標的影響，改良沖洗的清創方式預防術后感染效果優于傳統倒水法的清創方式。

清創；開放性創口；早期感染；PCT；TNF-α；APN

全球每年因創傷致死者約200余萬人，傷數千萬人[1]，其中，部分外傷會破壞皮膚的完整性，如軟組織、肌肉撕裂或挫傷，這種開放性、復雜性的骨外傷多半會伴隨感染風險，繼而導致傷口或骨折的延遲愈合，嚴重者甚至會因為膿毒血癥導致死亡[2]。因此，開放性損傷被骨外科認為是最需要緊急處理的。開放性損傷初期處理最重要的就是徹底的沖洗清創[3]，多項資料表明單一的沖洗方式可以在一定程度上減少傷口感染率[4]，但效果并不滿意。多數研究僅是對單項指標的評價，缺乏對綜合多項指標的觀察，難以為選擇合理的沖洗液及沖洗壓力提供臨床指導。本研究通過大鼠開放性創傷實驗造模，采用不同沖洗液和沖洗壓力結合的改良方式與傳統沖洗方式對比，探討清創方式對控制開放性創傷感染的有效作用。部分研究表明免疫因子與感染的早期診斷和預后有密切的關系[5～7]。2015～2017年我院采用ELISA、QRT-PCR和Western blot技術，觀察感染的發生、發展、預后與免疫因子血清降鈣素原(PCT)、腫瘤壞死因子(TNF)-α和脂聯素(APN)的動態變化，從而為感染早期如何合理有效的選擇清創方式，選取正確的敏感指標和檢驗方式提供有利的實驗證明，為臨床早期把握感染征象，防止疾病的惡化，改善患者預后提供前期實驗依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物SD大鼠96只，SPF級，雌性，體重300～400 g，單籠飼養，重慶第三軍醫大提供，許可證號SCXK(渝)2012-0005，每天光照與黑暗時間各12 h，動物房溫度和濕度分別設置在20～22°C和40%～50%。所用籠具、飼料、墊料、飲水均高壓滅菌，實驗期間的灌胃、換水、添加飼料等操作均在超凈工作臺內進行，由專人管理。

1.2藥物與試劑肥皂液每500 ml生理鹽水包中溶解15 ml肥皂；生理鹽水500 ml；沖洗器(Pulsavac，Zimmer，Dover，OH)；大腸桿菌懸濁液(細菌數>1×109個/ml)；雙蒸水；水合氯醛為分析純(批號20150513)；Total RNA 提取試劑(RNAiso Plus)；RT Master Mix 逆轉錄試劑盒(日本 TAKARA 公司)；苯甲基磺酰氟(PMSF)、RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒(江蘇碧云天生物技術公司)；兔抗鼠 SHP 抗體(美國Bioworld公司)；ELISA 試劑盒(批號 201602，上海江萊試劑有限公司)；Stratagene熒光定量 PCR 儀(Mx3000P，美國 Agilent 公司)；Abbott(雅培)Aeroset全自動生化分析儀(美國雅培制藥有限公司)；聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳儀和電轉儀(美國 Bio-Rad 公司)。

1.3方法

1.3.1實驗分組及造模 SD大鼠分為正常組、對照組、肥皂水組、高壓肥皂水沖洗組、低壓肥皂水沖洗組(高壓組用40psi，低壓組用14psi)、生理鹽水組、高壓生理鹽水沖洗組和低壓生理鹽水沖洗組各12只。用電推剪及電剃須刀去除腹部毛發，面積約2 cm×3 cm，常規消毒后用無菌手術法切除皮膚，去掉皮下組織和部分肌肉，造成基底凹凸不平的創面，最深處可達骨膜外層。用大腸桿菌作為污染創面的細菌。將大腸桿菌懸濁液1 ml 均勻涂于各傷口表面，使局部細菌數>1×107個。

1.3.2標本采集 分別取各組沖洗后創傷中心部位組織2塊約 1 cm×1 cm×1 cm，裝于EP管中，放置液氮中快速冷凍，然后轉移至-80 ℃超低溫冰箱凍存待做RT-PCR和Western blot。分別于實驗后第1、3、7天按照設計的順序進行斷尾取血，每次使用血清管(美國BD公司)取血約0.8 ml，3000轉/分離心10分鐘，取上清液血清約0.2 ml。

1.3.3檢測指標 ①血清PCT、TNF-α和APN水平。采用放射免疫測定法測定血清PCT、TNF-α和APN的值，步驟按PCT、TNF-α和APN試劑盒說明進行。②皮膚組織PCT、TNF-α和APN mRNA水平。Trizol法提取大鼠皮膚總RNA，分光光度法測定260 nm與280 nm的OD值，用OD260/OD280估計RNA純度(2.0左右即為RNA純品)。按試劑盒說明進行反轉錄和RT-PCR擴增，RT-PCR數據收集由7.0 System SDS Software軟件完成，通過軟件計算所有樣品的CT值，以相應內參照基因進行校準，采用2-△△CT方法對各基因表達進行相對定量：△CT=CT(target)-CT(ref)；Avg。△CT(calibrator)=Avg。CT(target，calibrator)-Avg。CT(ref，calibrator)；△△CT=△CT-Avg。△Ct(calibrator)；2-△△CT表示通過參照基因校準的PCT m RNA、TNF-αmRNA、APN mRNA的相對表達水平。③皮膚PCT、TNF-α和APN蛋白表達。取各組大鼠冰凍皮膚組織約100 mg，剪碎后放入1 ml RIPA 裂解液中，加入PMSF10 μl，冰上勻漿后靜置30 min，4 ℃離心12000 r/min，20 min，取上清液，BCA 法測定待測樣品的總蛋白濃度。每孔上樣量為 40 μg蛋白配置為10 μl上樣體系，SDS-聚丙烯酰胺凝膠，上層5%濃縮膠，下層12%分離膠。電泳后采用 Bio-Rad Mini Trans-Blot轉移系統PVDF膜轉膜，5%蛋白封閉液封閉2.5 h，TBST洗膜10 min×3次，一抗結合，4 ℃過夜；TBST 洗膜10 min×3次，二抗常溫浸泡1.5 h，ECL化學發光顯色，Bio-Rad CCD 成像系統獲取圖像。

1.4統計學方法采用SPSS 17.0軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差表示，正態分布數據比較采用t檢驗，非正態分布數據比較采用秩和檢驗，多組間比較采用方差分析，方差齊者采用LSD檢驗，方差不齊者采用Tamhane’sT2檢驗；計數資料比較采用卡方檢驗；單向有序等級資料比較采用秩和檢驗或Ridit分析。P< 0.05為差異有統計學意義，P< 0.01為差異有顯著統計學意義。

2 結果

2.1實驗第1d血清PCT、TNF-α和APN的水平

從表1可知，實驗第1d，與正常組比較，對照組PCT、TNF-α細胞因子的水平均顯著升高(P< 0.05)，APN細胞因子水平顯著降低(P< 0.05)；與對照組比較，高壓肥皂水沖洗組、高壓生理鹽水沖洗組和低壓肥皂水沖洗組、低壓生理鹽水沖洗組PCT、TNF-α細胞因子的水平均顯著降低P< 0.05)，APN細胞因子的水平顯著升高(P< 0.05 )。

表1 實驗第1d各組大鼠PCT、TNF-α和APN水平 (ng/L)

*與對照組比較，P< 0.05；△與肥皂水組比較，P< 0.05；▲與生理鹽水組比較，P< 0.05

2.2實驗第3d血清PCT、TNF-α和APN的水平

從表2可知，實驗第3d，與正常組比較，對照組PCT、TNF-α細胞因子的水平均顯著升高(P< 0.05)，APN細胞因子水平顯著降低(P< 0.05)；與對照組比較，高壓肥皂水沖洗組、高壓生理鹽水沖洗組和低壓肥皂水沖洗組、低壓生理鹽水沖洗組PCT、TNF-α細胞因子的水平均顯著降低P< 0.05)，APN細胞因子的水平顯著升高(P< 0.05 )。

表2 實驗第3d各組大鼠PCT、TNF-α和APN水平 (ng/L)

*與對照組比較，P< 0.05；△與肥皂水組比較，P< 0.05；▲與生理鹽水組比較，P< 0.05

2.3實驗第3d血清PCT、TNF-α和APN的水平從表3可知，實驗第7d，與正常組比較，對照組PCT、TNF-α細胞因子的水平均顯著升高(P< 0.05)，APN細胞因子水平顯著降低(P< 0.05)；與對照組比較，高壓肥皂水沖洗組、高壓生理鹽水沖洗組和低壓肥皂水沖洗組、低壓生理鹽水沖洗組PCT、TNF-α細胞因子的水平均顯著降低P< 0.05)，APN細胞因子的水平顯著升高(P< 0.05 )。

表3 實驗第7d各組大鼠PCT、TNF-α和APN水平 (ng/L)

*與對照組比較，P< 0.05；△與肥皂水組比較，P< 0.05；▲與生理鹽水組比較，P< 0.05

2.4大鼠皮膚組織PCT、TNF-α和APNmRNA的表達從表4可知，與正常組比較，對照組PCT、TNF-α mRNA的水平均明顯上調(P< 0.05)，APN mRNA的水平明顯下調(P< 0.05)；與對照組比較，高壓肥皂水沖洗組、高壓生理鹽水沖洗組和低壓肥皂水沖洗組、低壓生理鹽水組作用7d后PCT、TNF-αmRNA的水平均明顯下調(P< 0.05)，APN mRNA的水平明顯上調(P< 0.05 )。

表4 各實驗組大鼠PCT、TNF-α和APNmRNA水平 (2-△△CT)

*與對照組比較，P< 0.05；△與肥皂水組比較，P< 0.05；▲與生理鹽水組比較，P< 0.05

2.5皮膚組織中PCT、TNF-α和APN蛋白的表達從表5可知，與正常組比較，對照組PCT、TNF-α mRNA的水平均明顯上調(P< 0.05)，APN mRNA的水平明顯下調(P< 0.05)；與對照組比較，高壓肥皂水沖洗組、高壓生理鹽水沖洗組和低壓肥皂水沖洗組、低壓生理鹽水組作用7d后PCT、TNF-αmRNA的水平均明顯下調(P< 0.05)，APN mRNA的水平明顯上調(P< 0.05 )。

表5 各實驗組大鼠PCT、TNF-α和APN蛋白水平 (2-△△CT)

*與對照組比較，P< 0.05；△與肥皂水組比較，P< 0.05；▲與生理鹽水組比較，P< 0.05

3 討論

開放性創傷患者常常并發全身炎癥反應綜合征(SIRS)、膿毒癥及多器官功能障礙綜合征(MODS)，其中膿毒癥是嚴重創傷、燒傷、休克、大手術后常見的并發癥，是創傷患者重要的死亡原因之一。探討開放性創傷的感染早期敏感指標并找到合理的清創模式，及時檢查出并發感染的可能，降低感染率，促進創面修復以及阻止疾病的惡化已成為外科醫生關注的重點。因此，實驗中設計將壓力與沖洗液的選擇進行不同搭配組合，通過對感染指標的檢驗，找到最符合臨床需要的改良沖洗方式，在開放性損傷的初期就極大降低感染率。

PCT由116個氨基酸殘基組成，相對分子質量約13000，由特異蛋白酶將其剪切為降鈣素、降鈣蛋白和N2末端殘基，是降鈣素的前體物質[8]。正常情況下甲狀腺C細胞生成分泌前降鈣素，而在其他器官組織如肝臟、肺臟、腎臟、睪丸及神經內分泌細胞和單核細胞都有PCT-I和PCT-II mRNA的表達[9]。研究認為PCT可作為細菌早期感染的標志物及預后指標，PCT水平與炎癥進展相關，PCT水平持續升高提示感染源持續存在，預后不良，經有效治療24 h后PCT水平下降，表明治療有效，動態觀察PCT水平變化可以監測病情變化[10]。研究表明[11]，PCT可用于鑒別細菌及非細菌感染，也可用于明確發熱患者的病因，在自身免疫性疾病引起的發熱患者中，不伴細菌感染時，PCT水平在正常水平，當伴細菌感染時，PCT不同水平升高，而其它炎癥因子不論在伴不伴發感染時均升高。

TNF-α被認為是介導內毒素損傷效應的關鍵介質之一，過量的TNF不僅自身激活直接作用于各器官、組織、細胞誘導損傷，而且可誘導產生其他細胞因子如白細胞介素6(IL-6)，使TNF-α的生物學效應進一步放大，而引發了一系列細胞因子級聯反應，刺激產生一系列有害物質[12]，對機體造成繼發性損傷[13，14]，是反映機體炎癥與組織損傷嚴重程度的重要敏感指標[15]。有學者認為嚴重創傷發生后，血液中炎性細胞因子相繼升高，TNF最早出現，并迅速達到高峰，在MODS發生、發展的整個過程中起了關鍵的核心作用[16]。臨床研究發現TNF不僅可早期預測外傷后MODS的發生，而且可以作為預測預后的標志物，如患者血漿TNF持續高水平存在，則患者發展成MODS以致死亡的可能性很大，從而可幫助判斷預后[17]。

APN是一種由已知Acrp30、AdipQ、apM1和GBP28基因決定、脂肪細胞分泌的內源性生物活性蛋白質，由Scherer等[18]于1995年在小鼠3 T3-L1前脂肪細胞系的分化過程中分離克隆發現。有研究發現低APN水平可能具有抑制巨噬細胞活性、抗炎癥反應等作用，并促進血液循環中炎性因子如TNF、IL-6等分泌增加[19]。有研究結果證實[20]：在內毒素(LPS)誘發的大鼠膿毒血癥模型中，血漿APN濃度在注射LPS后4 h就開始出現下降，到24 h時降至約為正常對照組的50%。而脂肪組織中APN表達水平于注射LPS后24 h也顯著降低。通過相關分析發現：脂肪組織中APNmRNA表達水平與血漿APN水平具有高度相關性。這說明在膿毒癥等急性炎癥反應中也會出現低APN血癥，機體APN濃度的高低與膿毒癥的發生與發展有關。血清APN水平降低可能是膿毒癥發生發展的重要因素，其機制可能與降低APN對膿毒癥患者炎癥反應的抑制作用有關，提示APN水平是反映膿毒癥病情及評價預后的一項重要參考指標。

目前研究表明，感染的發生以及預后好壞與PCT密切相關，感染發生后，機體中PCT和TNF會同時升高，這點通過本實驗也得到了證實；同時，實驗研究中發現APN與TNF在感染發生的過程中呈負相關關系，但它能否直接調節LPS誘導的炎癥因子(PCT、TNF)的產生以及起到調節機制，目前并不清楚，有待于進一步的深入探討。本實驗中設計在感染早期就檢測PCT、TNF、APN三項指標，探究了各類炎癥因子在感染早期的相互作用以及不同檢驗方式中的表達，從而可以幫助臨床診療過程中更早的發現早期感染征象，同時又節約醫療資源地把握軟組織感染及壞死的發生發展進程。

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Experimentalstudyontheeffectofimproveddebridementmethodonsensitivemarkersforearlyinfectionofopenwound

LUbing1，ZHAOChan-juan2，ZHONGZhen-dong

(1.SichuanAcademyofMedicalScience&SichuanProvincialPeople’sHospital，Chengdu610072，China；2.WestChinaSecondUniversityHospital，SichuanUniversity，Chengdu610041，China)

ZHAOChan-juan

ObjectiveTo evaluate the effect of improved debridement method on sensitive markers for early infection of open wound.MethodsNinety-six SD rats were divided into 8 groups.Except for the normal group，the skin of each group was removed by sterile operation.Moreover，the subcutaneous tissue and part of the muscle were removed to make the uneven wound surface.One ml of Escherichia coli suspension (bacteria count >1 × 109/ml) was evenly placed on the surface of the wound in which the local number of bacteria was larger than 1 × 107.The wounds in the control group were not washed，and the rest groups were treated with soap water and physiological saline for 1 day，3 days and 7 days.The specimens were collected respectively.The positive and negative expression of APN，TNF-α and PCT were determined in the occurrence，development，prognosis of infection by using ELISA，QRT-PCR and Western blot techniques.The effects of improved debridement method on sensitive markers for early infection of open wound were compared.ResultsCompared to the normal group，the levels of TNF-α and PCT in the control group were increased and the level of APN was decreased.The levels of TNF and PCT were decreased in the high and low pressure treatment group and the level of APN was increased (P< 0.01).Furthermore，the incidence of early postoperative infection was lower in the high-pressure soap water washing group and the high-pressure saline group than that in the low-pressure soap water and the low-pressure physiological saline group (P< 0.05).After 7 days，there was no significant difference in the level of PCT，TNF-α and APN in the traditional washing method group (P> 0.05).ConclusionFor effect of open wound infection on early sensitive index，improved washing debridement method is better than traditional method for prevention of postoperative infection.

Debridement；Open Wound；Early Infection；PCT；TNF-α；APN

趙嬋娟

R641

A

1672-6170(2017)06-0071-05

2017-03-21；

2017-05-23)