雷帕霉素自乳化緩釋微丸的研究

李紅橋，盧振，楊林，王雨來*

（1. 鄂東醫療集團黃石市中心醫院（湖北理工學院附屬醫院）藥學部，湖北 黃石 43500；2. 腎臟疾病發生與干預湖北省重點實驗室，湖北 黃石 43500）

雷帕霉素自乳化緩釋微丸的研究

李紅橋1,2，盧振1,2，楊林1,2，王雨來1,2*

（1. 鄂東醫療集團黃石市中心醫院（湖北理工學院附屬醫院）藥學部，湖北 黃石 43500；2. 腎臟疾病發生與干預湖北省重點實驗室，湖北 黃石 43500）

以溶解度結合偽三元相圖法，篩選與優化雷帕霉素液體自乳化處方。以羥丙甲基纖維素鈉為主要骨架型緩釋材料，采用擠出滾圓法制備一種新型的固體自乳化給藥系統——雷帕霉素自乳化緩釋微丸，并對其重分散性和體外釋藥進行了研究。結果表明：液體自乳化給藥系統的處方是：Capmul MCM（油相）∶辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯（表面活性劑）∶聚氧乙烯醚-35蓖麻油（表面活性劑）∶二乙醇單乙基醚（助表面活性劑）= 30∶28∶28∶14。制備成的緩釋微丸的目標收率為（92.8±2.51）%，遇到重分散后的粒徑是35.5±0.5 nm，在體外釋藥中表明微丸具有良好的緩釋性能。以上表明：采用該方法為雷帕霉素的臨床應用提供一種良好的應用方法。

雷帕霉素；自乳化給藥系統；微丸；緩釋；羥丙甲基纖維素鈉

雷帕霉素是一種三烯大環內酯類的新型免疫抑制劑，由于具有強大的免疫抑制作用和較小的神經和腎毒性[1]，因而在臨床上廣泛應用于器官移植和風濕性關節炎等自身免疫性疾病[2]，但是雷帕霉素極微溶于水、口服生物利用度低、對胃酸敏感和治療窗口窄導致不良反應較嚴重等原因[3]，嚴重限制了該藥在臨床上的療效發揮，因此改善雷帕霉素溶出度及提高生物利用度對臨床的應用尤為重要。

自乳化緩釋微丸是液體自乳化給藥系統采用輔料固化成直徑約為1 mm，一般不超過2.5 mm的小球狀的緩釋制劑[4]。它既能夠保持液體自乳化給藥系統和緩釋微丸的改善溶解度、提高生物利用度及緩慢釋放藥物的優點，又能夠克服液體自乳化給藥系統運輸、貯存和膠囊殼發生反應等缺點[5,6]。因此，本文以微晶纖維素、羥丙甲基纖維素鈉、乳糖為輔料固化雷帕霉素液體自乳化給藥系統，制備成新型的雷帕霉素自乳化緩釋微丸，并考察了微丸釋藥性能。

1 實驗部分

1.1 藥品與試劑

Capmul MCM（美國Abite公司）；聚氧乙烯醚-35-蓖麻油（CremophorEL）、聚乙二醇硬脂酸酯（Soutol HS-15）（德國BASF公司）；二乙二醇單乙基醚（Transcutol? P）、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯（Labrasol）（法國Gattefossé公司）；雷帕霉素原料藥（批號 060705，福建省科瑞藥業有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯（分析純，國藥集團化學試劑有限責任公司）；微晶纖維素（MCC）（101型，批號：160523，陜西省西安北方惠安化學工業有限公司）；乳糖（江蘇省常州朗生生物工程有限公司）；羥丙甲基纖維素鈉（HPMC）（K4M，中國上海卡樂康公司）；水為純凈水；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

激光粒度分析儀（Zetasizer Nano ZS，英國馬爾文公司）；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S，河南鄭州長城科工貿有限公司）；臺式微量高速離心機（H1650-W，湖南長沙市湘儀離心機儀器有限公司）；安捷倫1200高效液相色譜系統，配備有四元泵、紫外檢測器、自動進樣器、化學工作站；水浴恒溫振蕩器（SHA-B 型，江蘇省榮華儀器制造有限公司）。多功能滾圓機（CGC-350，中國重慶市英格造粒包衣技術有限公司）；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S，河南省鄭州長城科工貿有限公司）；軸向單螺桿擠出機（E-50，中國重慶市英格造粒包衣技術有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 雷帕霉素液體自乳化輔料的優化

通過測定雷帕霉素在不同輔料中的溶解度來優化輔料。將過量的雷帕霉素原料藥分別添加到裝有油，表面活性劑，助表面活性劑的離心管中，密封渦旋5 min后，置于（40±1）℃恒溫箱中水浴50 min并將制備完畢的混合物置于（37±1）℃恒溫搖床震蕩72 h后，將混合物于12 000 r·min-1下離心5 min，精密吸取上清液，經流動相稀釋至一定濃度后，用高效液相色譜法檢測，計算雷帕霉素在各輔料中溶解度。其中色譜條件為：色譜柱：Ultimate ODS色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫50 ℃；流動相為乙腈-甲醇-水=45∶34∶21（體積比）；流速為 1.0 mL·min-1；檢測波長為278 nm；進樣量為20 μL。

1.3.2 偽三元相圖的優化

采用偽三元相圖法研究液體自乳化給藥系統的處方配制比例。將表面積活性劑與助表面活性劑按設定好的比例混勻，作為混合乳化劑。精密稱取油相與混合乳化劑，混合表面活性劑與助表面活性劑的質量比值（Km）為 1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1的比例分別混勻，在溫度為（25±1）℃下用純水滴定，在滴定過程中所產生的變化，仔細觀察，并記錄體系變化臨界值時候的用水量，繪制偽三元相圖。

1.3.3 自乳化效率的考察

取偽三元相圖中面積最大而且能繼續稀釋的處方，加入100 mL水中，在磁力攪拌器中（溫度：(25±1)℃）充分攪拌使混合均勻，記錄從開始加入到形成穩定乳劑的時間，并對形成穩定乳劑的外觀進行評級。

1.3.4 載藥能力的測定

取偽三元相圖中面積最大而且能繼續稀釋的處方，加入過量的雷帕霉素原料藥，密封后渦旋，（40±1）℃水浴50 min，為了使充分溶解，并置于恒溫（37±1）℃搖床平衡震蕩72 h后，將混合物于5 000 r·min-1下離心10 min，精密吸取上清液，經流動相溶液溶解后用高效液相色譜法檢測，計算各處方的最大載藥量。

1.3.5 乳滴粒徑的測定

取偽三元相圖中面積最大而且能繼續稀釋的處方，在磁力攪拌器（37±1）℃攪拌下緩慢滴加到100 mL蒸餾水中，使其形成穩定的乳劑后，平衡30 min，采用激光納米粒度儀測定粒徑。

1.3.6 自乳化緩釋微丸的制備

按照處方量稱取帕霉素液體自乳化給藥系統30%、微晶纖維素19%、羥丙甲基纖維素鈉20%、乳糖 31%和精密量取水6 mL，將固體輔料按質量從小到大等量滴加，使混合均勻。再加入雷帕霉素液體自微乳化給藥系統，快速攪拌，混合均勻，即得到外觀略有潮濕的混合物；加入適量的純化水制備軟材，將軟材加入到微丸機中，以擠出速度為 65 r·min－1擠出，擠出完畢后，迅速加入到滾圓機中以650 r·min－1的速度滾圓 3 min，收集所有制備的微丸于（40±1）℃的恒溫烘干機中恒溫干燥24 h。

1.3.7 自乳化緩釋微丸的粒徑分析和目標收率

采用篩分法測定緩釋微丸的粒徑分布范圍，分別收集大于16目、16～24目、24～40目和小于40目的緩釋微丸，稱重，計算不同粒徑范圍的收率，其中16～24目為目標收率。

1.3.8 雷帕霉素自乳化微丸的重分散性

分別取 100 μL的液體自乳化給藥系統和 100 mg自乳化緩釋微丸加入到20 mL的磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）中，在磁力攪拌器（37±1）℃中快速攪拌24 h,使緩釋微丸充分裂解，待穩定后，在離心機以5 000 r·min-1離心5 min后，取上層液體，用納米激光粒度儀測定形成乳液的粒徑和多分散系數。1.3.9 雷帕霉素自乳化緩釋微丸體外釋藥研究

在同等條件下，制備三批雷帕霉素自乳化緩釋微丸。精密稱取適量填充于膠囊中，使每一粒膠囊含雷帕霉素約1 mg，參照《中國藥典》2015版第二部中附錄XC溶出度裝置第三法進行實驗，將膠囊裝入沉降籃中，以900 mL的磷酸鹽緩沖液（pH6.8）為釋放介質，溫度為（37±1）℃，轉速為100 r·min-1,進行實驗，每隔30 min取樣4 mL直至8 h，并及時在操作容器中補充空白介質4 mL，將取樣的溶液至于離心管中，在6 000 r·min-1的離心機中離心5 min后，取上清液過0.22μm的水溶性濾膜，取續濾液進行測定，計算累積釋放度。

2 實驗結果

2.1 雷帕霉素在不同輔料的溶解度

根據雷帕霉素在各輔料中的溶解度大小依次選擇液體自乳化給藥系統各處方的輔料，各數據見表1。

表1 雷帕霉素在油、表面活性劑、助表面活性劑的溶解度Table 1 Solubility of rapamycin in various oils, surfactants and co-surfactants

其中油相中Capmul MCM的溶解度最大，所以選擇Capmul MCM 為油相。在表面活性劑中辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯的溶解度最大，但是由于其是乳化能力不強，所以選擇其次較大聚氧乙烯醚-35-蓖麻油作為混合表面活性劑，在助表面活性劑中二乙醇單乙基醚的溶解度最大，所以確定二乙醇單乙基醚為助表面活性劑。綜上所述，雷帕霉素自乳化處方選擇Capmul MCM為油相，聚氧乙烯醚-35-蓖麻油和辛酸癸酸聚乙二醇為混合表面活性劑，二乙醇單乙基醚為助表面活性劑。

2.2 三元相圖的繪制

根據實驗，繪制的偽三元相圖如圖1所示，結果表明：Km為4∶1時自能無限稀釋的處方面積較其他比例大，所以選擇 Km 為4∶1。

圖1 不同比例偽三元相圖Fig.1 Different proportions of pseudo-ternary phase diagrams

2.3 自乳化效率、載藥能力、乳滴粒徑測定

依據偽三元相圖的結果，結合溶解度優化結果、粒徑的大小和均一性、自乳化時間等（表 2）考慮到自乳化粒徑大能太大和處方中表面活性劑比例不宜過高，確定液體液體自乳化給藥系統的處方為Capmul MCM（油相）∶聚氧乙烯醚-35蓖麻油（表面活性劑）∶辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯（表面活性劑）∶二乙醇單乙基醚（助表面活性劑）= 30∶28∶28∶14。

2.4 自乳化緩釋微丸的粒徑分析和目標收率

采用篩分法測定粒徑分布，結果顯示：未見直徑大于2.0 mm者，直徑為1.2～2.0 mm的微丸占總量(12.5±0.25)%；直徑為 1.0～1.2 mm 的占總量(63.5±1.25)%，直徑為 0.8～1.0 mm 的占總量(16.8±0.69)%（n=3），直徑＜0.8 mm 的占總量(7.2±0.32)%，粒徑較均勻，符合微丸的規定。所以采用該制備工藝，雷帕霉素自乳化緩釋微丸的目標收率為(92.8±2.51)%（n=3）。

2.5 自乳化微丸的重分散性

由表3可見，自乳化緩釋微丸遇水重分散后形成乳劑的粒徑稍有增大，但是仍在規定的范圍內，這表明自乳化微丸基本保持了液體自乳化的特性；但，粒多分散系數也稍有增大，原因可能是：自微乳給藥系統在溶劑中乳化的過程中受到輔料的影響，多分散系數增加，導致粒徑稍大。

表2 不同自乳化處方的自乳化時間、乳化前后乳劑的多分散系數外觀、乳化前后乳劑的粒徑和載藥量的測定結果（n=3）Table 2 Self-emulsifying time of different self-emulsifying prescriptions, appearance of polydispersity of emulsions before and after emulsification, determination of particle size and drug loading of emulsions before and after emulsification（n=3）

表3 前后粒徑和多分散系數對比（，n = 3）Table 3 Droplet size with polydispersity index of reconstituted micro-emulsion（，n = 3）

表3 前后粒徑和多分散系數對比（，n = 3）Table 3 Droplet size with polydispersity index of reconstituted micro-emulsion（，n = 3）

處方 粒徑/nm 多分散系數(PDI)液體自乳化給藥系統 26.7±0.2 0.125±0.019自乳化緩釋微丸 35.5±0.5 0.335±0.023

2.6 雷帕霉素自乳化緩釋微丸體外釋藥研究

依據緩釋制劑的要求[7]：在t=120 min時，釋放度約為30%，t=240 min時，釋放度約為50%，t=480 min，釋放度大于80%。根據圖2，雷帕霉素自乳化緩釋微丸在120 min時候，釋放度為31.54±3.12%，在240 min時候，釋放度為51.25±4.76%，在480min時，釋放度為83.16±4.52%，均符合緩釋制劑的要求。這可能是在微丸中清斌甲基纖維素鈉具有強大的吸收能力，形成厚厚的凝膠層，溶蝕慢，從而導致藥物的緩慢釋放[8]。

圖2 三批緩釋微丸的釋藥曲線(n=3)Fig.2 Drug release curves of three batches of sustained-release pellets

3 結 論

采用高效液相色譜法測定雷帕霉素在各輔料中的溶解度，來優化液體自乳化給藥系統中的輔料。以偽三元相圖法結合自乳化效率、微乳的粒徑來確定液體自乳化給藥系統的處方及比例是：Capmul MCM（油相）∶辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯（表面活性劑）∶聚氧乙烯醚-35蓖麻油（表面活性劑）∶二乙醇單乙基醚（助表面活性劑）= 30∶28∶28∶14。將液體自乳化給藥系統 30%、微晶纖維素19%、羥丙甲基纖維素鈉20%、乳糖 31%和水6 mL制備成自乳化緩釋微丸，粒徑較均勻，符合微丸的規定且收率為（92.8±2.51）%，在磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）中，粒徑和多分散系數稍有增大，但在允許的范圍內；體外釋藥研究表明；該微丸具有良好的緩釋性能。

采用該方法制備雷帕霉素自乳化緩釋微丸，既能夠保持口服制劑的優點，有可能提高雷帕霉素的溶出度和生物利用度，為雷帕霉素的臨床應用提供一種新的方法。

［1］Yue Y，Tao C，Yang HY，et al．Preparation of mesoporous silica nanoparticles in different pore size and its use in the solidification of sirolimus loaded self -microemulsifying drug delivery system [J]. Acta Pharm Sin，2017，52 (6): 985-911.

［2］Chatel MA, Larkin DFB. Sirolimus and mycophenolate as combination prophylaxis in corneal transplant recipients at high rejection risk [J]. Am J Ophthalmol, 2010, 150: 179-184.

［3］劉志宏，胡雄偉，陶春，等. 西羅莫司國體自乳化給藥系統的研究[ J] . 藥學實踐雜志，20016, 34 (2): 142-147.

［4］宦娣，易濤，劉穎，等．擠出滾圓法制備吲哚美辛緩釋微丸［J］.中國藥房，2010，22 ( 17) : 1583-1586.

［5］吳昊，張晶，宋洪濤．西羅莫司納米脂質載體固化制劑的制備［J］.中國醫藥工業雜志，2012，43 (7)：562-567．

［6］Li GL, Fan YT, Zhang YH, et al. In vitro and in vivo evaluationof total flavones of hippophae rhamnoides self-microemlsifying drug delivery system [J]. Acta Pharm Sin, 2012, 47: 1055?1062.

［7］崔福德. 藥劑學[M]. 第6版. 北京：人民衛生出版社，2007：440+447.

［8］沈麗琳. 羥丙甲纖維素在藥物制劑方面的應用與研究[J]. 中國藥業，2007，16（12）：64-67.

Study on Rapamycin Self-emulsifying Sustained Release Pellets

LI Hong-qiao1,2，LU Zhen1,2，YANG Lin1,2，WANG Yu-lai1,2*
(1. Huangshi Central Hospital of Edong Healthcare Group, Affiliated Hospital of Hubei Polytechnic University, Hubei Huangshi 435000, China；2. Hubei Key Laboratory of Kidney Disease Pathogenesis and Intervention, Hubei Huangshi 435000, China)

The rapamycin liquid self-emulsifying drug delivery system was screened out and optimized by solubility test and pseudo-ternary phase diagram. Sodium hydroxypropyl methylcellulose was used as the main framework for sustained release material. A novel solid self-emulsifying drug delivery system,rapamycin self-emulsifying sustained release pellet was prepared by extrusion-spheronization method, its dispersibility and release in vitro were also studied.The result indicated that, the liquid formulation of self-emulsifying drug delivery system was as follows: Capmul MCM (oil phase): labrasol (surfactant): castor oil polyoxyethylene ether-35 (surfactant): diethylene monoethyl ether(cosurfactant) = 30:28:28:14. The target yield of prepared sustained-release pellet was（92.8±2.51）%, and the particle size after re-dispersion was (35.5±0.5)nm. The release test of pellet in vitro showed that the pellet had good sustained-release properties. The results above indicated that this method can provide a good way for clinical application of rapamycin.

Rapamycin; Self-emulsifying drug delivery system; Pellets; Sustained release; Methylcellulose

R945

A

1671-0460（2017）11-2266-04

黃石市科技局醫療衛生領域項目（HSYL2015000085）; 黃石市科技局醫療衛生領域項目(HSYL2016000087)。

2017-08-12

李紅橋（1986-），男，湖北黃岡人，藥師，碩士，2013年畢業于西南大學藥物分析專業，研究方向：從事固體自乳化給藥系統研究。E-mail：lixiaoganggg@163.com。

王雨來（1972-），男，主任藥師，研究方向：臨床藥學。E-mail：452411085@qq.com。