半夏快速繁殖及乙烯利對其增殖影響

李東海，汪 雷，徐 濤

(浙江理工大學 生命科學院，浙江 杭州 310077)

半夏快速繁殖及乙烯利對其增殖影響

李東海，汪 雷，徐 濤*

(浙江理工大學 生命科學院，浙江 杭州 310077)

半夏快速繁殖培養基為MS+6-BA 3.5 mg·L-1；生根培養基為MS+6-BA 3.5 mg·L-1+ NAA 0.5 mg·L-1；在生根培養基中，低強度光照利于半夏組培苗萌發幼芽；高強度光照有利于半夏組培苗幼葉的展開和生長；添加1 000倍商品用乙烯利有利于半夏塊莖的膨大和增殖。

半夏； 組織培養； 快速繁殖； 乙烯利

半夏Pinelliaternata又稱三葉半夏，為天南星科半夏屬多年生草本植物。中華人民共和國藥典記載[1]，藥用生半夏為半夏植株的干燥塊莖，具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結的功效，主要用于濕痰寒痰、嘔吐反胃、胸脘痞悶、梅核氣等，外治癰腫痰核。中國植物物種信息數據庫[2]記錄，除內蒙古、新疆、青海、西藏尚未發現野生植株外，全國各地均有廣布，一般于海拔2 500 m以下草坡、荒地、玉米地、田邊、疏林下常見，朝鮮、日本等也有分布。

半夏組織培養一般使用6-BA、NAA、2,4-D等調節劑經過數次繼代完成[3-5]，應用于實際生產工藝較復雜，且成本較高[6]。本試驗簡化了半夏組織培養的繼代次數，并使用6-BA、乙烯利[7](化學式為乙烯磷，白色結晶，在常溫常壓下，能緩慢釋放出乙烯)，促進了半夏塊莖的增殖。

1 材料與方法

1.1 材料

半夏塊莖產地為浙江杭州天目山地區，流水沖洗1～2 h，除去表面土壤，挑選沉入水中且質地堅硬飽滿的半夏塊莖用于種植，然后清水浸泡，每6～8 h換1次水，共浸泡48～72 h，播種于播種盤中；商用乙烯利購自浙江省花卉市場(浙江省農科院旁)，純度30%。

1.2 外植體滅菌

選取生長狀態良好且未長出珠芽的半夏葉柄，流水沖洗2 h，吸水紙瀝干后置于70%乙醇中，快速涮洗1～2次。然后放入含洗滌劑的0.1%HgCl2溶液中，搖勻8 min，用無菌水清洗3～5次，然后置于無菌濾紙片內，去除兩端，接種于培養基內。

1.3 無菌苗轉接

將接種超過1個月且已分化出葉片的無菌苗用小刀切開，接種于含6-BA 3.5 mg·L-1的MS培養基內。每當植株生長過盛時，即可分離繼代。

1.4 培養條件與方法

半夏無菌培養配方：處理1，2,4-D 2.0 mg·L-1，暗培養；處理2，2,4-D 2.5 mg·L-1，暗培養；處理3，2,4-D 2.5 mg·L-1，6-BA 0.5 mg·L-1，暗培養；處理4，NAA 0.5 mg·L-1，6-BA 2.5 mg·L-1，光培養；處理5，6-BA 3.5 mg·L-1，光培養；處理6，NAA 0.5 mg·L-1，6-BA 3.5 mg·L-1，光培養；處理7，2,4-D 2.5 mg·L-1，暗培養→14 d后光培養；處理8，6-BA 3.5 mg·L-1，光培養→14 d后暗培養。

光培養的光照條件為1 000 lx，12 h·d-1；暗培養為避光培養。二者的培養溫度均為(25.5±1)℃。

1.5 乙烯利處理半夏無菌苗

乙烯利使用0.22 μm孔徑濾膜過濾除菌，然后用純水分別稀釋10、100、1 000倍，待半夏接入不含激素的組培瓶內7 d后，每瓶添加1 mL稀釋后的乙烯利。

1.6 半夏組培苗的生根和移栽

將乙烯利處理過的半夏組培苗分離切割，接入6-BA 3.5 mg·L-1和NAA 0.5 mg·L-1的MS培養基內(每瓶內培養基添加較少，半夏塊莖需埋入培養基內)。前期光照條件為500 lx，12 h·d-1，培養溫度為(25.5±1)℃；待有新芽抽出后轉入1 500 lx光照下將移栽的半夏組培苗提前2 d敞開組培瓶蓋，加入清水浸沒塊莖。然后植入滅菌過的土壤內，覆上干苔蘚或干草。

2 結果與分析

2.1 培養處理對半夏愈傷組織的誘導

表1為8種培養條件下半夏的生長情況。以接種30 d統計性狀，并記錄愈傷誘導率和嫩芽誘導率。其中，處理1、2、3形成半透明的泡狀細胞，無組織分化傾向(分化情況a)；處理4在7 d左右莖葉卷曲，有類似珠芽萌發于創口，20 d左右先萌發根，后長出葉片(分化情況b1)；處理5在7 d左右莖葉卷曲，有類似珠芽萌發于創口，20 d左右長出葉片，但不萌發根(分化情況b2)；處理6在7 d左右莖葉卷曲，有類似珠芽萌發于創口，20 d左右長出葉片，萌發根(分化情況b3)。處理7的泡狀細胞偶有綠色星點位于細胞表面，后來無明顯變化(分化情況c)；處理8珠芽繼續萌發生長，長出白色莖葉，無根(分化情況d)。

表1 不同培養處理條件下半夏組織培養情況對比

2.2 半夏的芽增殖培養

如圖1所示，半夏在6-BA 3.5 mg·L-1培養基中培養，3 d時接種外植體切口處開始外翻；8 d時全部呈現泡狀，有白色嫩芽開始分化，出現于切口處；13 d時大量嫩芽出現，莖干中斷也有大量嫩芽；21 d時產生大量愈傷組織，原本嫩芽部分開始萌發出芽；28 d時大量芽分化萌發出來，開始出現葉片，整個植株團簇狀；35 d時葉片形成，少數開始生長出根部。

圖1 半夏增殖培養生長狀況

2.3 半夏組培苗的生根誘導和移栽

如圖2所示，半夏無菌苗接入并浸入6-BA 3.5 mg·L-1和NAA 0.5 mg·L-1的MS培養基內，大約15 d左右有根誘導分化(A)；將其放置于低強度光照條件下，會有大量芽分化出來(B)；然后將其轉移至稍強光照后，原本幼葉展開，并增大至正常形態(C)；將煉苗后的半夏組培苗種植于花盆內，并附上干苔蘚(D)。

圖2 半夏組培苗的后期處理

2.4 乙烯利處理下半夏的塊莖變化

如圖3所示，正常組織培養狀態半夏塊莖簇集成大團，青綠色，且一般塊莖上存在著半夏幼苗的萌芽，生長活力好，質地較為堅硬，有光澤(A)；0.1%乙烯利時，半夏塊莖仍為青綠色，生長活力較好，質地稍微松軟(B)；1%乙烯利時，塊莖由青綠色轉為土黃色，活力逐漸喪失，質地也更為松軟(C)；當乙烯利濃度達到10%時，半夏塊莖全部變為土黃色，簇集成團的塊莖松散開來，大部分塊莖呈現糜爛狀態，幾乎完全喪失了活性，即使后期更換正常培養后，無明顯改變(D)。

圖3 不同濃度乙烯利催化后半夏塊莖生長狀況

3 小結與討論

光照對半夏嫩芽和芽的分化是必要條件，當無光照培養時，半夏易于產生愈傷組織；當光照強度在500 lx時，半夏生長和芽的分化較多；光照強度在1 500 lx時，有利于葉片的伸展和增大。在生長調節劑選取方面，6-BA和NAA均對半夏組織培養有促進作用，但6-BA更能影響半夏的嫩芽生成和幼芽的萌發，NAA促進半夏的根的誘導，2,4-D則有利于愈傷組織的分化。從試驗中可以看出，0.1%乙烯利能促進半夏生長，增加組培瓶內半夏塊莖的增殖，但不影響塊莖的生成和其營養物質的積累；而更高濃度的乙烯利則抑制半夏生長，降低塊莖的活性，使其營養物質積累受阻，部分開始降解、自溶。

本試驗使用配方簡單，易于操作，且增殖系數大。通過調節光照強度，省略了傳統組織培養的愈傷組織的脫分化和芽誘導步驟，直接從外植體分化出幼芽，并擴增幼芽的基數，促進葉片的展開和生長。在實際生產應用中，一定程度上減少了無菌苗的轉接次數，減少污染的可能；由于培養基更換量較少，降低了半夏組織培養的成本，節約了培養時間，適宜實際生產應用。

[1] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典1部[S]. 北京：中國醫藥科技出版社，2015.

[2] 中國科學院. 中國植物物種信息數據庫[DB/OL]. http://db.kib.ac.cn/eflora/view/search/Chs_contents.aspx?CPNI=CPNI-128-15201.

[3] 劉鑫欣，崔曉星，劉金欣，等. 不同植物生長調節劑對半夏愈傷組織誘導效應的研究[J].中國中醫藥信息雜志，2011(5)：57-59.

[4] 宋艷梅，李峰，劉楊. 半夏組織培養快速繁殖研究[J]. 山東中醫藥大學學報，2010(4)：368-369.

[5] 賈明良，方荷芳，張本厚. 三葉半夏叢生塊莖途徑擴繁及塊莖分離技術研究[J]. 中國農業科技導報，2016(6)：181-186.

[6] 趙桂芳. 半夏組織培養成本分析[J]. 現代農業科技，2015(10)：91-92.

[7] 祁利潘，孫明磊，李夢. 乙烯利對“冀張薯8號”產量和耐貯性的影響[C]//中國作物學會馬鈴薯專業委員會會議論文集，2016.

(責任編輯：張瑞麟)

2017-09-06

國家自然科學基金(30772712)

李東海(1988—)，男，湖北武漢人，碩士研究生，從事藥用植物代謝方面的研究工作，E-mail：493539063@qq.com。

徐 濤(1962—)，男，教授，從事藥用植物快速繁殖和代謝方面的研究工作，E-mail：pkuxt@aliyun.com。

文獻著錄格式：李東海，汪雷，徐濤. 半夏快速繁殖及乙烯利對其增殖影響[J].浙江農業科學，2017，58(11)：1986-1988.

10.16178/j.issn.0528-9017.20171136

Q813.2+2

A

0528-9017(2017)11-1986-03