超聲作用下脂肪酶催化菜籽油水解反應(yīng)研究

劉 寧， 陳倩楠， 石青云， 陳雪峰， 李 騁， 李 超

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

超聲作用下脂肪酶催化菜籽油水解反應(yīng)研究

劉 寧， 陳倩楠， 石青云， 陳雪峰， 李 騁， 李 超

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

以菜籽油為原料，研究了不同反應(yīng)器中脂肪酶Lipozyme TL IM催化油脂水解反應(yīng)效果.結(jié)果表明，探頭式超聲波作用下，Lipozyme TL IM催化菜籽油水解效果較好，其工藝條件為：溫度55 ℃、底物摩爾比(水/油)60∶1、加酶量0.9%(w/w)、超聲發(fā)生模式50%，經(jīng)20 min反應(yīng)時(shí)間，最終可得到水解液酸價(jià)為82.74 mg KOH/g.若僅采用攪拌器方式，達(dá)到同等水解效果，需用時(shí)300 min，可見(jiàn)超聲波作用大大縮短了反應(yīng)時(shí)間.利用GC-MS分析了樣品的脂肪酸組成，發(fā)現(xiàn)菜籽油在水解后不飽和脂肪酸含量略有降低.

超聲波； 菜籽油； 水解； 脂肪酶Lipozyme TL IM； 脂肪酸組成

0 引言

油菜是我國(guó)主要的油料作物之一，油菜籽的含油量為37.5%～46.3%，菜籽油常作為普通食用油，目前其深加工開(kāi)發(fā)利用程度較低.將植物油水解后，可得到脂肪酸等產(chǎn)品，作為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的基料，如制備單甘酯、甘油二酯、生物柴油等新產(chǎn)品[1-3].近年來(lái)，利用脂肪酶對(duì)油脂進(jìn)行水解的研究日益受到重視[4,5].

隨著多學(xué)科的相互交叉、滲透和聲學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究者們發(fā)現(xiàn)超聲波對(duì)多種反應(yīng)體系具有廣泛的適用性，其應(yīng)用領(lǐng)域不斷拓展[6-10].利用超聲輔助油脂水解，可有效提高水解反應(yīng)速率和水解效果[11].由于酶催化和超聲技術(shù)都具有條件溫和、副反應(yīng)少、環(huán)境友好等特點(diǎn)，本文對(duì)超聲作用下脂肪酶Lipozyme TL IM催化菜籽油水解反應(yīng)的影響因素進(jìn)行了研究，包括反應(yīng)溫度、底物摩爾比、加酶量、超聲強(qiáng)度和反應(yīng)時(shí)間等，并利用GC-MS對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行了分析，研究結(jié)果可為菜籽油的深度開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菜籽油，益海嘉里(興平)食品工業(yè)有限公司；脂肪酶Lipozyrne TL IM，脂肪酶Lipozyme RI IM，磷脂酶Lecitase Ultra，丹麥諾維信公司；三丁酰甘油酯，日本東京株式會(huì)社；氫氧化鉀、乙醇等均為分析純.

1.2 儀器與設(shè)備

探頭式超聲波發(fā)生器,蘇州海納科技有限公司；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司；JBZ-14H型磁力攪拌器,上海大浦儀器有限公司；HH-4數(shù)顯電子恒溫水浴鍋,江蘇金壇宏華儀器廠；Trace Ultra氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國(guó)Thermo Finnigan公司.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 脂肪酶活性的測(cè)定

采用水解三丁酰甘油酯pH-stat法測(cè)定脂肪酶活力，參考Mishra等[12]的方法.反應(yīng)緩沖液為0.005 mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH7.5，含0.025 mol/L CaCl2)，測(cè)定溫度為37 ℃.酶活定義為：在一定條件下，1 min水解三丁酰甘油酯產(chǎn)生1μmol丁酸所需的酶量，即為一個(gè)酶活力單位(U).

1.3.2 酸價(jià)測(cè)定

參考GB5009.229-2016食品中酸價(jià)的測(cè)定.

1.3.3 菜籽油水解反應(yīng)

實(shí)驗(yàn)研究了三種不同脂肪酶對(duì)菜籽油的水解效果，包括游離磷脂酶Lecitase Ultra、固定化脂肪酶Lipozyme RI IM、固定化脂肪酶Lipozyme TL IM.比較了四種不同處理方式對(duì)菜籽油水解效果的影響，包括磁力攪拌器、超聲清洗器、超聲發(fā)生器、超聲發(fā)生與磁力攪拌器聯(lián)用.超聲清洗器的功率為250 W，頻率為40 KHz.超聲發(fā)生器功率為200 W，頻率為20 KHz.其中，磁力攪拌與超聲發(fā)生器聯(lián)用裝置示意圖見(jiàn)圖1所示.

A:超聲發(fā)生器 B:超聲波探頭 C:磁力攪拌器 D:溫控裝置

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，將一定量菜籽油、水、脂肪酶加入到50 mL燒杯中，在水浴作用下，分別于四種不同反應(yīng)器中進(jìn)行反應(yīng).待反應(yīng)結(jié)束后，將水解液在10 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，測(cè)定上層油相的酸價(jià).

1.3.4 脂肪酸組成分析

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)分析樣品的脂肪酸組成，脂肪酸甲酯的制備參考汪勇[13]的方法.GC系統(tǒng)為T(mén)race Ultra GC(美國(guó)ThermoFinnigan公司)，配備Trisplus自動(dòng)進(jìn)樣器和四級(jí)桿DSQ II質(zhì)譜分析儀(MS).氣相色譜柱為T(mén)R-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.2 mm，0.25μm，美國(guó)ThermoFinnigan公司).樣品的進(jìn)樣體積為1.0μL，分流比100∶1.以氦氣為載氣，流速1.0 mL/min.進(jìn)樣口溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃.氣相色譜程序升溫條件為：初始爐溫40 ℃(保持1 min)，以10 ℃/min升溫速率升至150 ℃(保持2 min)，再以10 ℃/min升溫速率升至220 ℃，最后以5 ℃/min升溫速率升至280 ℃(保持3 min).每次進(jìn)樣前，設(shè)備系統(tǒng)溫度保持在40 ℃.質(zhì)譜掃描范圍為50～500 m/z.

2 結(jié)果與討論

2.1 酶活測(cè)定

實(shí)驗(yàn)選用游離磷脂酶Lecitase Ultra、固定化脂肪酶Lipozyme RI IM和固定化脂肪酶Lipozyme TL IM進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，首先測(cè)定了它們的活力，結(jié)果分別為2 835 U/g、2 060 U/g和3 033 U/g，可見(jiàn)三種酶的活力均較好.

2.2 不同反應(yīng)器對(duì)酶促水解效果的影響

以磷脂酶Lecitase Ultra、脂肪酶Lipozyme RI IM、脂肪酶Lipozyme TL IM分別在同等條件下，于4種不同反應(yīng)器中進(jìn)行菜籽油水解催化反應(yīng)，反應(yīng)15 min后，測(cè)定上層油相酸價(jià)，比較各反應(yīng)效果，結(jié)果如表1所示.

表1 不同反應(yīng)器中所得樣品酸價(jià)(mg KOH/g)

注：同一行的不同字母表示差異顯著(plt;0.05).

由表1可知，在4種反應(yīng)器中，不同脂肪酶對(duì)菜籽油水解反應(yīng)均有一定的催化能力，其催化能力大小順序?yàn)椋篖ipozyme TL IMgt;Lecitase Ultragt;Lipozyme RI IM.不同反應(yīng)器的作用效果由強(qiáng)到弱依次為：反應(yīng)器四gt;反應(yīng)器三gt;反應(yīng)器一gt;反應(yīng)器二.綜合來(lái)看，在反應(yīng)器四(超聲發(fā)生+磁力攪拌器)中，Lipozyme TL IM較其他兩種酶所得產(chǎn)物酸價(jià)最高，水解最為徹底.這可能是因?yàn)槌暟l(fā)生器具有較強(qiáng)的空化效應(yīng)，能促使酶分子發(fā)揮其催化活力[14].同時(shí)在攪拌作用下，酶在體系中的狀態(tài)更為分散，因而該反應(yīng)器中水解效果遠(yuǎn)優(yōu)于其他樣品.故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中均采用這一方法.

2.3 脂肪酶水解菜籽油工藝條件研究

2.3.1 溫度的影響

以菜籽油為底物，在加酶量0.5%(w/w)、底物摩爾比(水/油)70∶1、超聲作用下(反應(yīng)器四)反應(yīng)20 min，改變體系的溫度，測(cè)定45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃時(shí)水解液的酸價(jià)，研究溫度對(duì)水解反應(yīng)效果的影響.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2所示.

圖2 溫度對(duì)水解效果的影響

由圖2可知，當(dāng)反應(yīng)溫度低于55 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，酸價(jià)增大.溫度為55 ℃時(shí)，酸價(jià)最高，為71.55 mg KOH/g，這可能是由于該酶在此時(shí)處于最適酶活溫度，催化效率最大.當(dāng)溫度為55 ℃～65 ℃時(shí)，則隨著溫度的升高，酸價(jià)降低，水解程度下降.根據(jù)余旭亞等[15]研究結(jié)果，溫度對(duì)酶促作用的影響表現(xiàn)為：在低溫范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，反應(yīng)體系分子活化能增加，分子碰撞幾率增加，反應(yīng)速率加快，表現(xiàn)為酶催化活力升高；由于大多數(shù)酶是蛋白質(zhì)，當(dāng)溫度超過(guò)酶的最適溫度時(shí)，酶蛋白就會(huì)逐漸產(chǎn)生變性作用而減弱甚至喪失催化活性，酶分子發(fā)生不可逆熱變性而失活，引起催化反應(yīng)速率下降，催化活力降低.酶所表現(xiàn)的最適溫度就是這兩種影響的綜合結(jié)果，此時(shí)酶的催化活力表現(xiàn)為最大.因此，本實(shí)驗(yàn)最終選擇菜籽油水解反應(yīng)溫度為55 ℃.

2.3.2 底物摩爾比的影響

以菜籽油為底物，在加酶量0.5%(w/w)、反應(yīng)溫度55 ℃、超聲作用(反應(yīng)器四)下反應(yīng)20 min，改變體系的底物摩爾比(水/油)，測(cè)定其30∶1、50∶1、60∶1、70∶1、90∶1時(shí)水解液的酸價(jià)，研究底物摩爾比對(duì)水解反應(yīng)效果的影響.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示.

圖3 底物摩爾比對(duì)水解效果的影響

從圖3可以發(fā)現(xiàn)，在水解過(guò)程中，當(dāng)?shù)孜锬柋?水/油)小于60∶1時(shí)，隨著摩爾比的增加，酸價(jià)不斷增大；當(dāng)?shù)孜锬柋却笥?0∶1時(shí)，酸價(jià)呈現(xiàn)遞減的趨勢(shì).當(dāng)摩爾比分別是30∶1、60∶1、70∶1和90∶1時(shí)，所得酸價(jià)值的差異較顯著(plt;0.05).當(dāng)?shù)孜锬柋葹?0∶1時(shí)，酸價(jià)最高，為70.80 mg KOH/g.這與黃健花等[16]的研究結(jié)果較為一致，在超聲作用下加入少量的水即可達(dá)到較好的水解效果，可認(rèn)為與超聲波能夠促進(jìn)反應(yīng)體系的乳化作用有關(guān)，可以形成更大的油/水界面，從而實(shí)現(xiàn)水的"充分利用"；當(dāng)加水量逐漸增加，使得酶的相對(duì)濃度減小，造成酸價(jià)減小.因此，本實(shí)驗(yàn)最終選擇反應(yīng)底物摩爾比(水/油)為60∶1.

2.3.3 加酶量的影響

以菜籽油為底物，在反應(yīng)溫度55 ℃、底物摩爾比(水/油)60∶1、超聲作用(反應(yīng)器四)下反應(yīng)20 min，改變體系的加酶量，測(cè)定其0.1%、0.5%、0.9%、1.2%、2.0%、3.0%時(shí)水解液的酸價(jià)，研究加酶量對(duì)水解反應(yīng)效果的影響.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4所示.

圖4 加酶量對(duì)水解效果的影響

在一定條件下，反應(yīng)速度隨著加酶量的增加而加快，當(dāng)反應(yīng)界面被酶所飽和時(shí)，反應(yīng)速率達(dá)最大；繼續(xù)增大加酶量，反應(yīng)速率不再增加[6].由圖4可知，在超聲作用下，當(dāng)加酶量在0.1%～0.9%時(shí)，反應(yīng)效率隨著加酶量的增大而提高，且呈現(xiàn)顯著性差異(plt;0.05).加酶量為1.2%時(shí)，其水解液酸價(jià)和加酶量0.9%所得樣品相比，無(wú)顯著性差異性.當(dāng)其超過(guò)1.2%后，反應(yīng)速率隨著加酶量的增加反而有所降低.造成這種現(xiàn)象的原因可能是，過(guò)高的加酶量導(dǎo)致了酶分子聚結(jié)，不利于其有效分散，從而使反應(yīng)效率降低[17].另外，由于酶的價(jià)格相對(duì)較貴，如酶的用量太高不利于工業(yè)化生產(chǎn).因此，本實(shí)驗(yàn)最終選擇菜籽油水解反應(yīng)加酶量為0.9%.

2.3.4 超聲發(fā)生模式的影響

本實(shí)驗(yàn)所用探頭式超聲發(fā)生器有20%、50%和連續(xù)式3種超聲發(fā)生模式.前述實(shí)驗(yàn)均采用50%發(fā)生模式.以菜籽油為底物，在加酶量0.9%(w/w)、反應(yīng)溫度55℃、底物摩爾比(水/油)60∶1條件下反應(yīng)20 min，研究不同超聲發(fā)生模式對(duì)酶促反應(yīng)影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2所示.

表2 超聲發(fā)生模式對(duì)水解效果的影響

注：同一列的不同字母表示差異顯著(plt;0.05).

由表2可知，超聲發(fā)生模式對(duì)酶催化水解反應(yīng)有較大影響.若不運(yùn)用超聲處理，僅使用磁力攪拌，對(duì)照樣的酸價(jià)僅18.52 mg KOH/g.當(dāng)超聲模式為20%時(shí)，反應(yīng)水解液酸價(jià)為69.64 mg KOH/g；而連續(xù)的超聲模式對(duì)酶的催化反應(yīng)起到一定的抑制作用(其水解液酸價(jià)為71.39 mg KOH/g)，這可能是由于超聲強(qiáng)度過(guò)大，其空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)等引起了酶分子一定程度的失活[18].可以發(fā)現(xiàn)，50%的超聲發(fā)生模式下Lipozyme TL IM催化能力最強(qiáng)，水解產(chǎn)物酸價(jià)最高，為82.74 mg KOH/g，較其他模式呈顯著性差異(plt;0.05).因此，本實(shí)驗(yàn)選擇較適宜超聲發(fā)生模式為50%.

2.3.5 反應(yīng)時(shí)間的影響

以菜籽油為底物，在加酶量0.9%(w/w)、反應(yīng)溫度55 ℃、底物摩爾比(水/油)60∶1，超聲發(fā)生模式50%條件下進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)定一定反應(yīng)時(shí)間后水解液的酸價(jià)，研究反應(yīng)時(shí)間的影響.同時(shí)與攪拌條件下(反應(yīng)器一)的反應(yīng)效果進(jìn)行對(duì)比，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5所示.

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)水解效果的影響

由圖5可以發(fā)現(xiàn)，兩種反應(yīng)器中水解液酸價(jià)隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，但分別在20 min和300 min后逐漸趨于穩(wěn)定.這可能是因?yàn)樗夥磻?yīng)在此時(shí)已接近平衡，即使延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，對(duì)反應(yīng)效果沒(méi)有明顯的提高[19].超聲作用(反應(yīng)器四)時(shí)間為20 min時(shí)，酶催化作用達(dá)到最大，反應(yīng)液酸價(jià)為82.74 mg KOH/g，而攪拌模式(反應(yīng)器一)達(dá)到相近的催化效果則需300 min.因此，超聲作用對(duì)水解反應(yīng)的促進(jìn)效果明顯，可將反應(yīng)時(shí)間從300 min縮短至20 min，大大節(jié)省了反應(yīng)時(shí)間，提高了反應(yīng)效率.

2.4 脂肪酸組成分析

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)測(cè)定了水解前后菜籽油的脂肪酸組成，結(jié)果如表3所示.

表3 菜籽油水解前后脂肪酸組成分析

由表3可以發(fā)現(xiàn)，菜籽油中所含脂肪酸包括棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、花生酸、花生烯酸等，以不飽和脂肪酸為主.水解后，油相中飽和脂肪酸含量有所增加，而不飽和脂肪酸含量略有降低.這與汪勇研究大豆油水解反應(yīng)的結(jié)果類似[13].由于本實(shí)驗(yàn)所用原料為低芥酸菜籽油，水解前后均無(wú)芥酸檢出.

3 結(jié)論

采用探頭式超聲發(fā)生器與磁力攪拌聯(lián)用，以脂肪酶Lipozyme TI IM催化菜籽油水解反應(yīng)，表現(xiàn)出較好的催化反應(yīng)效率.最終得到菜籽油水解的工藝條件為：溫度55 ℃、底物摩爾比(水/油)60∶1、加酶量0.9%(w/w)、超聲發(fā)生模式50%、水解時(shí)間20 min，所得水解液油相的酸價(jià)為82.74 mg KOH/g.若僅采用磁力攪拌，達(dá)同等反應(yīng)效果需用時(shí)300 min，可見(jiàn)超聲作用大大提高了催化效率.本論文研究結(jié)論可為探頭式超聲裝置在油脂催化中的應(yīng)用提供一定的參考依據(jù).

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【責(zé)任編輯：蔣亞儒】

Studyonultrasonicassistedlipase-catalyzedhydrolysisofrapeseedoil

LIU Ning, CHEN Qian-nan, SHI Qing-yun, CHEN Xue-feng, LI Cheng, LI Chao

(School of Food and Biological Engineering， Shaanxi University of Science amp; Technology, Xi′an 710021, China)

In the present study,the lipase Lipozyme TL IM-catalyzed hydrolysis of rapeseed oil in different reactors was studied. The result showed under the action of probe-type ultrasonic,the hydrolysis conditions of rapeseed oil catalyzed by Lipozyme TL IM were as follows:reaction temperature of 55 ℃,the molar ratio of substrates (water/oil) of 60∶1,enzyme load of 0.9% (w/w),ultrasonic mode of 50%,and reaction time of 20 min.The acid value of hydrolyzate was determined as 82.74 mg KOH/g.However,when a stirrer reactor was employed,it needed 300 min to obtain the same hydrolysis result.It was showed that the ultrasonic can reduce the reaction time to a large extent.GC-MS was employed to analyze the fatty acid compositions of rapeseed oil and its hydrolyzate.The result revealed that after hydrolysis,the content of unsaturated fatty acids decreased slightly.

ultrasonic; rapeseed oil; hydrolysis; lipase Lipozyme TL IM; fatty acid composition

2017-10-11

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31501443)； 陜西省科技廳自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2014JQ3111)； 陜西科技大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(BJ15-02)； 陜西省2017年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201710708041)

劉 寧(1984-)，男，四川巴中人，講師，博士，研究方向：糧油食品加工、食品乳狀體系

2096-398X(2017)06-0109-05

Q814.2

A